劉玉鵬， 彭中友， 郭日紅， 雷明明， 于建寧， 陳瑞愛， 施振旦

(1.廣東省獸用生物制品生物技術(shù)研究與應(yīng)用企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，肇慶大華農(nóng)生物藥品有限公司，廣東 肇慶526238;2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州510642;3.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所，江蘇 南京210014)

生長分化因子9(Growth differentiation factor9，GDF9)，是轉(zhuǎn)化生長因子-β(Transforming growth factor-β，TGFβ)超家族的一員，在動物卵巢組織中高水平表達(dá)，是最先被發(fā)現(xiàn)的對卵泡發(fā)育有重要調(diào)控作用的細(xì)胞因子［1］。卵泡的發(fā)育需要GDF9 的調(diào)控，由卵母細(xì)胞分泌的GDF9 促進(jìn)卵泡的正常發(fā)育。母羊GDF9 基因純合突變導(dǎo)致體內(nèi)缺乏GDF9，則母羊的卵泡發(fā)育停留在初級卵泡階段而不能發(fā)育至次級卵泡階段，導(dǎo)致母羊不育［2-3］。但GDF9 基因雜合突變體母羊，雖然其體內(nèi)GDF9 生成量僅及野生型羊的一半，但初級卵泡向次級卵泡的發(fā)育不受影響，而有腔卵泡的成熟提前發(fā)生，包括提高了卵泡顆粒細(xì)胞對促卵泡激素(FSH)的反應(yīng)性、以及在較早發(fā)育時期的顆粒細(xì)胞就表達(dá)促黃體素受體(LHR)和較早就具有合成和分泌孕酮的能力，從而在較早發(fā)育時期就能夠?qū)ε怕亚按冱S體素(LH)高峰作出反應(yīng)，導(dǎo)致排卵數(shù)和產(chǎn)羔數(shù)的增加［4］。因此可以通過免疫GDF9 的方法人為調(diào)控體內(nèi)GDF9 的生物學(xué)活性，如長期或重度免疫使抗體能夠中和抑制體內(nèi)絕大部分GDF9，將使具有正常生殖機(jī)能的母羊的卵泡發(fā)育停留在初級階段而不能發(fā)育至次級卵泡階段以上而導(dǎo)致羊的不育;而如果僅是輕度免疫GDF9使產(chǎn)生的抗GDF9 抗體效價較低，則可以提高正常羊的排卵數(shù)和產(chǎn)羔數(shù)［2，5］。因此通過基因工程獲得GDF9 蛋白質(zhì)作為免疫原，用于免疫母羊或其他動物，則理論上有可能促進(jìn)卵泡提前發(fā)育成熟和提高排卵數(shù)，最后用于開發(fā)提高羊繁殖力的新技術(shù)。

此外，在對卵子體外成熟和胚胎的體外生產(chǎn)研究中，還發(fā)現(xiàn)卵子分泌的GDF9 能夠影響周圍的卵丘細(xì)胞的發(fā)育和功能［6-7］。通過卵子與卵丘細(xì)胞之間雙向交流促進(jìn)卵子的成熟和受精后早期胚胎的發(fā)育質(zhì)量。如在小鼠卵子體外成熟培養(yǎng)液中添加外源GDF9 能促進(jìn)卵丘細(xì)胞的擴(kuò)散［8］，提高卵子質(zhì)量和顯著促進(jìn)胚胎的發(fā)育以及提高胚胎移植后胎兒的成活率［7，9］。將能夠分泌GDF9 的裸卵加入卵子的培養(yǎng)體系中后，也可以大幅提高囊胚率和早期胚胎的發(fā)育質(zhì)量［10-12］。因此目前國內(nèi)大范圍開展的以現(xiàn)代胚胎生物技術(shù)為基礎(chǔ)的動物轉(zhuǎn)基因研究中，可能需要使用GDF9 以提高卵子的IVM(體外成熟)、胚胎(包括克隆胚)的生產(chǎn)數(shù)量和質(zhì)量以及移植后的轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)效率。

本研究首先克隆水牛GDF9 成熟肽cDNA 序列，然后利用原核表達(dá)其重組蛋白質(zhì)并進(jìn)一步制備抗體，以應(yīng)用于提高羊繁殖性能新技術(shù)開發(fā)和促進(jìn)動物卵子IVM、胚胎體外生產(chǎn)和轉(zhuǎn)基因動物研究。

1 材料和方法

1.1 載體和菌株

pMD18-T 載體購自TaKaRa 公司，E. coli DH5α、E.coli BL21(DE3)和pRSET-A 由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院動物生殖生理學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 試劑和酶類以及實(shí)驗(yàn)動物

限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ、Hind Ⅲ、Ex Taq DNA聚合酶、DL2000 分子量標(biāo)準(zhǔn)、T4 連接酶及膠回收試劑盒均為TaKaRa 公司產(chǎn)品。用于純化的帶His-tag的50% Ni-NTA 凝膠(Qiagen)購自基因公司。用于純化GDF9 多克隆抗體的Protein A Sepharose 購自北京康為世紀(jì)生物公司。辣根過氧化酶(HRP)標(biāo)記羊抗兔IgG 購自北京鼎國生物技術(shù)有限公司。新西蘭大白兔購自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。

1.3 水牛GDF9 成熟肽基因序列的克隆以及重組蛋白質(zhì)的表達(dá)和純化

根據(jù)水牛GDF9 基因編碼區(qū)的核苷酸序列(GenBank:FJ529501.1)設(shè)計(jì)并由上海英駿公司合成1 對引物。上游引物Up 序列為:5'-TTCGGATCCGACCAGGAGAGTGTCAGCT-3'，含 有BamHⅠ酶切位點(diǎn)(下劃線部分);下游引物Down 序列為:5'-GACAAGCT TTACTTTGTGG CTATCATATCTTC -3'，含有Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)(下劃線部分)，加粗堿基為終止密碼子。

將水牛基因組DNA 作為模板，用引物Up 和Down 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，并將擴(kuò)增得到的396 bp 的GDF9 片段克隆入pMD18-T 載體構(gòu)建重組質(zhì)粒pGDF9，并將pGDF9 轉(zhuǎn)化入E. coli DH5α 株增殖復(fù)制。

抽提pGDF9 并用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切，經(jīng)凝膠電泳分離回收GDF9 cDNA 片段，并克隆入表達(dá)載體pRSET-A 的BamH Ⅰ和Hind Ⅲ兩位點(diǎn)之間，構(gòu)建pR-GDF9。將pR-GDF9 轉(zhuǎn)化E. coli BL21(DE3)，用IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)GDF9 重組蛋白質(zhì)。經(jīng)SDS-PAGE 驗(yàn)證蛋白質(zhì)的表達(dá)和分子大小之后，用50%Ni-NTA 凝膠在變性條件下進(jìn)行純化。

1.4 GDF9 多克隆抗體的制備和純化

將純化并透析復(fù)性后的GDF9 重組蛋白質(zhì)與礦物油混合制成含1 mg/ml 重組蛋白質(zhì)的油乳劑，并對新西蘭大白兔進(jìn)行肌肉及皮下多點(diǎn)注射此油乳劑1 ml 進(jìn)行免疫。經(jīng)過連續(xù)3 次間隔14 d 的免疫注射之后，在第3 次免疫后10 d 頸動脈放血收集全血并使之凝固。然后離心分離血清，用飽和硫酸銨沉淀免疫球蛋白IgG 之后，進(jìn)一步用Protein A Sepharose 純化多克隆抗體，純化抗體保存于-20 ℃。

1.5 ELISA 檢測抗血清效價

將GDF9 抗原稀釋至濃度為10 μg/ml包被96微孔酶標(biāo)板，每孔加入100 μl，4 ℃包被過夜，于次日倒掉包被液，用洗滌液(0.05% Tween +PBS)洗3次;加5% BSA-PBS 于37 ℃封閉1 h，洗滌3 次后依次加免疫血清、HRP 抗兔IgG (1∶ 4 000稀釋)，洗滌步驟同前;加底物TMB，37 ℃顯色25 min，加2 mol/L硫酸終止反應(yīng)后，讀取450 nm 吸光值。

1.6 15 個物種間GDF9 基因成熟肽同源性分析

從GenBank 獲取15 種動物GDF9 基因cDNA序列信息，包括黃牛、綿羊、山羊，豬、鼠、人和兔等。用Mega4.1 軟件［13］對15 個物種的GDF9 基因成熟肽進(jìn)行同源性分析以構(gòu)建進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 水牛GDF9 成熟肽基因的克隆和同源性分析

以水?；蚪MDNA 為模板，用引物Up 和Down擴(kuò)增出1 條大約396 bp 的片段，再克隆入質(zhì)粒pMD18-T 載體并在E.coli DH5α 株增殖復(fù)制后測序，確認(rèn)為GDF9 成熟肽基因序列。

所擴(kuò)增的水牛GDF9 成熟肽基因與牛的同源性最高，達(dá)到98%，而與斑馬魚的同源性最低，僅34%，與其他反芻動物如山羊、中國麝香鹿和綿羊的也高度同源，分別達(dá)到94.9%，94.7% 和94.7%。從進(jìn)化樹(圖1)可以看出15 個物種分類為2 大類，即哺乳類和魚類。哺乳動物又可以分為4 類:水牛和黃牛聚為最近的一類，山羊和綿羊聚為一類，繼而他們與中國麝香鹿聚為一類，形成反芻動物類。

2.2 水牛GDF9 基因在E.coli BL21(DE3)中的表達(dá)及純化

所構(gòu)建的表達(dá)載體pR-GDF9 用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切，產(chǎn)生1 條約396 bp 的片段及1 條約2 876 bp 的載體片段。另將pR-GDF9 測序，結(jié)果顯示GDF9 基因序列片段已經(jīng)正確插入載體并維持了正確的閱讀框架。

轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒pR-GDF9 的E. coli BL21(DE3)株在LB(AMP +)液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)并經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)后，表達(dá)出分子量約為1.96 ×104的重組GDF9蛋白質(zhì)(圖2 左);在加入0.1 mmol IPTG 誘導(dǎo)4 h后蛋白質(zhì)的表達(dá)量最高，達(dá)到總菌體蛋白質(zhì)的30%左右(圖2 左)。在變性條件下經(jīng)50% Ni-NTA 樹脂洗脫該蛋白質(zhì)，再用Ni-NTA 凝膠純化分離，分離純化的純度達(dá)到95%以上(圖2 右)。

2.3 ELISA 法檢測血清抗體效價

圖3 顯示新西蘭兔在免疫GDF9 重組蛋白質(zhì)之后的血清中抗GDF9 的抗體效價(由ELISA 分析的OD 值代表)。免疫前血清的抗體效價始終處于較低的非特異結(jié)合水平，免疫2 次后的效價有所上升，免疫3 次后的效價則進(jìn)一步升高。第3 次免疫后血清抗體濃度稀釋至1∶ 51 200時，P/N 值仍然大于2(以P/N ＞2 判斷為陽性)，即說明抗體效價達(dá)到1∶ 51 200。

圖1 用Mega4.1 軟件獲得的15 個物種的進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic tree of 15 species obtained by using Mega4.1 software

圖2 原核表達(dá)(左)和經(jīng)Ni-NTA 凝膠純化(右)的GDF9 重組蛋白質(zhì)(箭頭所示)電泳圖譜Fig.2 Protein electrophoresis (left)and Ni-NTA agarose gel purification (right)of recombinant GDF9 protein(arrows indicate)

2.4 抗GDF9 多克隆抗體的純化

抗血清經(jīng)硫酸銨沉淀之后所分離的蛋白質(zhì)再經(jīng)Protein A Sepharose 特異性親和層析，洗脫收集的蛋白質(zhì)在SDS-PAGE 電泳顯示較純的單一輕鏈和重鏈條帶(圖4)，圖像豐度計(jì)算顯示純化的抗體純度達(dá)到96%以上。用ELISA 法測定純化后抗體的效價，純化后1.2 mg/ml多克隆抗體按倍比稀釋，隨著抗體濃度越來越低，顯色越來越淺，稀釋至1∶ 6 400時P/N 值仍大于2(圖5)。

3 討論

本研究克隆獲得的水牛GDF9 成熟肽基因序列與黃牛的同源性最高，達(dá)到98%;與其他反芻動物也高度同源，如與山羊、中國麝香鹿和綿羊的同源性分別達(dá)到94.9%、94.7%和94.7%。利用15 個物種的序列所構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹說明該基因在哺乳動物尤其是反芻動物間功能比較保守，也與其他生長分化因子在不同物種之間高度保守相類似［14］。

圖3 抗血清中抗GDF9 抗體效價的ELISA 測定值Fig.3 ELISA determination of anti-GDF9 antibody titres in antiserum

圖4 純化的多克隆抗體的SDS-PAGE 結(jié)果Fig.4 SDS-PAGE result of purified polyclonal antibody

圖5 純化的多克隆抗GDF9 抗體效價的ELISA 檢測Fig.5 ELISA determination of anti-GDF9 antibody titres of purified polycolonal antibody

將水牛GDF9 基因插入表達(dá)質(zhì)粒pRSET-A 的BamHⅠ和Hind Ⅲ兩酶切位點(diǎn)之間，表達(dá)1 個168 個氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)，其中N 端36 個殘基包括6XHis 的組氨酸標(biāo)簽源自pRSET-A 的序列，C 端的132 個殘基則源自GDF9。整個重組水牛GDF9 成熟肽融合蛋白質(zhì)的理論分子量為19 162。經(jīng)過多重PCR 擴(kuò)增、酶切和連接等操作，獲得了閱讀框正確的表達(dá)供體pR-GDF9，并表達(dá)了分子量約為1.96×104的蛋白質(zhì)，與理論值相符。同時，由于所表達(dá)的重組蛋白質(zhì)可由Ni-NTA 凝膠結(jié)合并因此被純化，說明蛋白質(zhì)分子中具有來源于表達(dá)載體pRSET-A 的6 個連續(xù)組氨酸標(biāo)簽序列(His-Tag)。這些結(jié)果都說明分子克隆操作和所表達(dá)的重組蛋白質(zhì)分子表達(dá)的正確性，為下一步工作和研究奠定了基礎(chǔ)。

同屬于TGFβ 超家族成員的GDF9 和BMP15(骨形態(tài)發(fā)生蛋白15)的羧基端具有很高的同源性［15-16］。在目前發(fā)現(xiàn)的一些高產(chǎn)羊品種中，很多是GDF9 和BMP15 基因突變造成發(fā)育的大卵泡提前成熟從而增加排卵數(shù)和提高了產(chǎn)仔數(shù)，而且GDF9和BMP15 基因突變在提高母羊排卵數(shù)方面有加性效應(yīng)［3］。而在人為的免疫調(diào)控研究中，McNatty等［2］利用BMP15 和GDF9 作為抗原對僅產(chǎn)單羔的母羊進(jìn)行免疫，發(fā)現(xiàn)在輕度免疫后使體內(nèi)抗體效價不太高時，都能夠提高母羊的排卵率和產(chǎn)羔數(shù)。因此本研究所制備的抗原GDF9 可作為抗原用于免疫提高母羊排卵數(shù)和產(chǎn)羔數(shù)的新技術(shù)研發(fā)。此外，由于本研究所制備的GDF9 重組蛋白質(zhì)包含成熟肽的完整序列，GDF9 與BMP15 成熟肽的羧基端具有很高的同源性［15-16］，因此免疫之后產(chǎn)生的抗體也可能與BMP15 結(jié)合，因而有可能最大限度地提高羊的排卵數(shù)。

除了對卵泡發(fā)育有重要的調(diào)控作用，GDF9 還具有影響卵子成熟和受精后胚胎發(fā)育的重要調(diào)控作用［6，10］。例如在小鼠卵子體外成熟培養(yǎng)液中添加GDF9，可以顯著增加受精后卵子發(fā)育至囊胚的比例［10］。推測GDF9 的這一作用是通過影響卵子周圍的放射冠細(xì)胞的功能而實(shí)現(xiàn)的。但動物繁殖中另一重要的過程，即卵子受精之后的胚胎的發(fā)育，是如何受到GDF9 的影響，目前還不清楚。由于一些生長分化因子，如卵泡抑素和與GDF9 相似的活化素，在卵子和胚胎之間表現(xiàn)出類似于對立統(tǒng)一的相反的調(diào)控作用［16-19］，因此GDF9 是否也類似于活化素而對發(fā)育的胚胎有負(fù)調(diào)控作用，這一問題目前并不明了，需要進(jìn)一步研究。本研究所制備的高純度抗GDF9 抗體，可以應(yīng)用于GDF9 調(diào)控胚胎發(fā)育的研究工作。

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