倪艷秀， 何孔旺， 周俊明， 汪 偉， 呂立新， 俞正玉， 茅愛華， 溫立斌，張雪寒， 李 彬， 胡屹屹， 郭容利， 王小敏， 陸承平

(1.江蘇省農業(yè)科學院獸醫(yī)研究所，農業(yè)部獸用生物制品工程技術重點實驗室，國家獸用生物制品工程技術研究中心，江蘇南京210014;2.南京農業(yè)大學動物醫(yī)學院，江蘇 南京210095)

豬鏈球菌是一種重要的人獸共患病病原菌，根據(jù)菌體莢膜多糖抗原的不同，可分成35 個血清型(1 ～34 及1/2 型)［1］，其中以2 型流行最廣，其次是1 型和9 型。1998 年～1999 年在江蘇省南通地區(qū)、2005 年夏季在四川省資陽地區(qū)所暴發(fā)的豬鏈球菌病均由豬鏈球菌2 型所引起。

豬鏈球菌2 型的致病性與毒力因子密切相關。目前公認的主要毒力因子有溶菌酶釋放蛋白(Muramidase-released protein，MRP)、胞外因子(Extracellular protein factor，EPF)、莢膜多糖(Capsular polysaccharide，CPS)和溶血素(Suilysin，SLY)等。豬鏈球菌溶血素(亦稱豬溶素)屬于巰基活化毒素家族(Thiol-activated cytolysins group，TACY)，由497 個氨基酸組成，其中有27 個氨基酸組成的信號肽序列，分子量為5.4 ×104［2］。不僅豬鏈球菌2 型能產生溶血素，其他血清型(1、1/2、3 ～5、7、9、10、14、15、17 ～21、23、28、33、34 型)等亦能產生［3-4］。SLY 除能溶解多種動物的紅細胞外，還對多種細胞有毒性作用。Charlands 等［5］報道SLY 可引起人腦微血管內皮單層細胞產生病變。Norton 等［6］報道SLY 能引起HEp-2 細胞的裂解。陳國強等［7］證實SLY 可引起Vero 細胞的圓縮和脫落。但目前對溶血素的致病機理還不明確。SLY 可刺激機體產生免疫反應，是一種重要的保護性抗原。Jacob 等［8］報道以純化的SLY 免疫BALB/c 小鼠，小鼠不僅體內能產生SLY 抗體，而且受到致死劑量的全菌攻擊時，還全部得到保護。Jacob 等［9］進一步以純化的SLY 免疫豬，豬不僅體內也能產生SLY 抗體，而且受到全菌攻擊時，只表現(xiàn)一過性的、輕微的癥狀，而對照組則表現(xiàn)出以跛行、精神抑郁、發(fā)熱等為特征的嚴重臨床癥狀。陳國強等［7］應用純化的SLY 免疫豚鼠，可抵抗同源全菌的攻擊。

本試驗用分子生物學方法，以豬鏈球菌2 型江蘇分離株SS2-1 的基因組為模板，擴增除信號肽序列外的溶血素成熟蛋白基因，并定向克隆到表達載體pET-32α 中，進行sly 基因的原核表達，并進行純化蛋白質的生物學活性和免疫保護性的初步研究，為進一步研究SLY 的致病機理和研制亞單位疫苗奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株及來源

豬鏈球菌2 型分離株SS2-1 系1998 年從江蘇省如皋市發(fā)病豬體內分離。表達質粒pET-32α(+)、宿主菌大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α、BL21(DE3)由江蘇省農業(yè)科學院獸醫(yī)研究所保存。

1.2 主要試劑和儀器

THB(Todd-Hewitt broth)為美國BD 公司產品。Ex Taq 酶、DL2000 marker、DL15000 marker、pMD18-T 載體、BamH I 和Xho I、T4 DNA 連接酶和膠回收試劑盒均為大連寶生物工程有限公司產品。Ni-NTA His resin 為Novagen 公司產品。兔抗粗制SLY高免血清自制。羊抗兔IgG-HRP 和DAB 顯色試劑盒為武漢博士德公司產品。

TP-600 型PCR 熱循環(huán)儀(日本Takara 公司產品);ELITE300 型電泳儀(美國Wealtec 公司產品);DYCP-31D 型水平電泳槽(北京六一儀器廠產品);高速冷凍離心機(德國Hettich 公司產品);THZ-C恒溫震蕩器(太倉實驗儀器廠產品);復日RF-980生物電泳圖像分析系統(tǒng)(上海復日科技有限公司產品);Synergy 超純水器(美國Millipore 公司產品)。

1.3 細菌培養(yǎng)

挑取血平板上的SS2-1 單菌落接種于THB 肉湯中，37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜。

1.4 細菌基因組DNA 提取

收集過夜SS2-1 THB 肉湯培養(yǎng)物1 ml，12 000 r/min離心5 min，棄上清。用200 μl TE 緩沖液重懸菌體，煮沸10 min，再次離心取上清，即為擴增用模板，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 PCR 擴增

引物設計和合成:根據(jù)我們已登陸在GenBank中的SS2-1 的sly 基因序列(GenBank AY341263)，用Primer Premier 5 軟件設計引物，在引物兩端分別加限制性酶切位點BamHⅠ和XhoⅠ及保護性堿基。引物P1 序列為5'-GGGGGATCCGATTCCAAACAAGATA-3'，P2 序列為5'-TTTCTCGAGTCTCTATCACCTCATCCGCA-3'。引物由大連寶生物工程有限公司合成，可擴增除信號肽外的溶血素成熟蛋白基因。

PCR反應體系:10 × Reaction buffer 5 μl，25 mmol/L MgCl22 μl，2.5 mmol/L dNTPs 2 μl，50 μmol/L P1 1 μl，50 μmol/L P2 1 μl，SS2-1 模板DNA 3 μl，ddH2O 35 μl，Ex Taq 酶1 μl，共50 μl。

PCR 反應條件:95 ℃預變性5 min，94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，擴增35 個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。

1.6 重組表達質粒pET32α-sly 的構建及鑒定

PCR 產物在1%瓊脂糖凝膠上電泳分離后，用膠回收試劑盒回收，連接于pMD18-T Vector，轉化于感受態(tài)細胞DH5α 中，通過藍白斑篩選陽性菌落，提取質粒，用BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切鑒定。雙酶切產物膠回收后再與BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切的pET-32α(+)連接，連接產物轉化于感受態(tài)細胞BL21(DE3)中，PCR 和雙酶切進行克隆的鑒定，對鑒定的陽性克隆(命名為pET32α-sly)進行測序(由大連寶生物工程有限公司完成)。

1.7 重組蛋白質的誘導表達

將陽性菌落過夜培養(yǎng)物以2%的比例接種于LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600=0.4 ～0.6，加入IPTG 至終濃度為1 mmol/L，37 ℃誘導表達，每隔1 h 收集菌體，用12%SDS-PAGE 電泳進行鑒定。

1.8 重組蛋白質的定位

將誘導后表達量達到最高時的重組菌進行超聲波裂解，12 000 g 離心10 min。分別取上清、沉淀及全菌裂解液進行12% SDS-PAGE 電泳。

1.9 重組蛋白質的純化

將誘導后表達量達到最高時的重組菌進行超聲波裂解，12 000 g 離心10 min，收集上清。參照說明書，進行鎳柱親和層析，純化后的蛋白-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.10 純化蛋白質的Western blotting 鑒定

采用半干轉印法［10］。將純化蛋白質進行SDSPAGE 分析，電泳后用硝酸纖維膜(NC 膜)，將凝膠在Tris-Gly 緩沖系統(tǒng)中轉移電泳，0.65 mA/cm2轉印100 min，5%脫脂乳封閉過夜。以兔抗粗制SLY 高免血清為一抗(1∶ 50 稀釋)，羊抗兔IgG-HRP 為二抗(1∶ 1 000稀釋)，DAB 顯色試劑盒顯色。

1.11 純化蛋白質的溶血活性測定

測定方法參照Jacobs 等［8］和Gottschalk 等［11］的方法稍加改動。將濃度為0.1 mg/ml的純化蛋白質加入終濃度為5 mmol/L的二硫蘇糖醇(DTT)，室溫(25 ℃)作用30 min 恢復溶血活性。用生理鹽水進行倍比稀釋，各加30 μl 至96 孔V 型板，再加入等量的1%綿羊或1%雞紅細胞，37 ℃作用2 h 后觀察溶血情況。同時設生理鹽水作陰性對照，硫氧還蛋白質作空白對照。

1.12 純化蛋白質的細胞毒性測定

將濃度為0.5 mg/ml的純化蛋白質經(jīng)過濾除菌后，加入終濃度為5 mmol/L的二硫蘇糖醇(DTT)，室溫(25 ℃)作用30 min 恢復溶血活性。用無血清的DMEM 進行倍比稀釋后，加入已長滿單層的Vero或HEp-2 細胞上，于5% CO2環(huán)境下37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察其細胞毒性。同時設無血清DMEM 作陰性對照，硫氧還蛋白質作空白對照。

1.13 純化蛋白質的免疫保護性試驗

將純化蛋白質用0. 3% 甲醛滅活后，按每只每次50 μg 免疫18 ～20 g BALB/C 小鼠。一免后14 d 二免，二免后21 d 用2 倍最小致死量(MLD)的SS2-1(每只2 ×108CFU)進行腹腔注射攻毒，觀察10 d。同時設全菌細胞滅活苗組和空白對照組。

2 結果

2.1 重組質粒的酶切鑒定

PCR 產物經(jīng)膠回收后，連接于pMD18-T Vector，轉化于感受態(tài)細胞DH5α 中，通過藍白斑篩選陽性菌落，提取質粒，用BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切鑒定。雙酶切產物經(jīng)膠回收后再定向克隆至pET-32α(+)中，獲得重組質粒，命名為pET32α-sly。經(jīng)PCR 鑒定陽性，并用BamHⅠ和XhoⅠ進行雙酶切，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，可見有5 900 bp 和1 400 bp左右的片段，與預期的片段大小一致，說明溶血素基因已成功克隆(圖1)。

2.2 誘導時間的確定

重組菌經(jīng)1 mmol/L IPTG 誘導1 h 后即產生分子量約7.2 ×104的目的條帶，與理論值相符。誘導4 h 后達到高峰，用復日Smart View 電泳圖像分析軟件分析，結果表明，其表達量約占菌體總蛋白質的20%(圖2)。

圖1 重組質粒的酶切鑒定Fig.1 Restriction endonuclease analysis of recombinant plasmid

圖2 不同誘導時間表達產物的SDS-PAGE 分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of expression product induced for different time

2.3 表達蛋白質的定位

經(jīng)超聲波裂解、12% SDS-PAGE 電泳鑒定、復日Smart View 電泳圖像分析軟件分析，結果表明表達產物在上清和包涵體中各占50%左右(圖3)。

2.4 重組蛋白質的Western blotting 鑒定

誘導產物經(jīng)超聲波處理后，上清用鎳柱親和層析，純化的蛋白質基本為單一條帶。Western blotting結果表明，純化的蛋白質(分子量7.2 ×104)可與兔抗粗制SLY 高免血清反應，說明純化蛋白質含有SLY 的抗原決定簇(圖4)。

2.5 純化蛋白質的溶血活性

濃度為0.1 mg/ml的純化重組蛋白質rSLY 倍比稀釋2-9倍和2-7倍，分別能使能使1%綿羊紅細胞、1%雞紅細胞完全溶解，而作為陰性對照的生理鹽水和作為空白對照的硫氧還蛋白質均不能引起溶血(圖5)。對綿羊紅細胞的溶血效價為1.707×105HU/mg，對雞紅細胞的溶血效價為4.267×104HU/mg。

圖3 超聲波裂解表達產物的SDS-PAGE 分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of expression product after sonication

圖4 Western blotting 分析Fig.4 Western blotting analysis

2.6 純化蛋白質的細胞毒性

濃度為0.5 mg/ml的純化重組蛋白質rSLY 經(jīng)28稀釋后對Vero 和HEp-2 細胞均能產生細胞毒性，主要表現(xiàn)為引起細胞的顆粒增多、圓縮和脫落(圖6)。而作為陰性對照的生理鹽水和作為空白對照的硫氧還蛋白均不能引起細胞病變。

2.7 純化蛋白質的免疫保護性

將純化重組蛋白質rSLY 用0.3%甲醛滅活后，按每只每次50 μg 免疫18 ～20 g BALB/c 小鼠，一免后14 d 二免，二免后21 d 用2 倍MLD 的SS2-1 進行攻毒，觀察10 d，結果是全菌滅活苗組小鼠完全受保護(6/6)，重組蛋白質組83.3%(5/6)受保護，而對照組基本在1 d 內全部死亡，主要表現(xiàn)是精神沉郁、減食和神經(jīng)癥狀(表1)。

圖5 rSLY 的溶血活性Fig.5 Hemolytic activity of rSLY

圖6 rSLY 對HEp-2 的細胞毒性Fig.6 Cytotoxicity of rSLY to HEp-2

表1 rSLY 對BALB/c 小鼠的免疫保護性Table 1 Immunoprotection of BALB/c mice by rSLY

3 討論

豬鏈球菌病是一種重要的人獸共患病，常規(guī)疫苗在一定范圍內有一些保護作用，但是有很多不足之處，最主要的原因是豬鏈球菌的血清型很多，各型之間幾乎沒有交叉保護作用，從而導致該病的診斷、治療及預防很困難。豬鏈球菌溶血素存在于多種血清型中，是一種重要的毒力因子和交叉保護性抗原，所以對它的研究一直是熱點。通常需要從培養(yǎng)上清中提純，由于其產量低，而且產量與培養(yǎng)條件密切相關，所以純化時要嚴格控制培養(yǎng)條件，提取過程非常麻煩，需要用超濾、親和層析、凝膠過濾等，代價昂貴，效率低［7，11］。而獲得較純的豬鏈球菌溶血素，將有助于對其進行功能研究和亞單位疫苗的研制，也有助于闡明豬鏈球菌的致病機理。

基于以上的考慮，許多學者都對豬鏈球菌溶血素進行了體外原核表達，但大多表達的是溶血素基因的部分片段，而成熟蛋白的獲得也許對蛋白質的免疫原性研究不是必須的，但對蛋白質的晶體結構、生物學特性和致病機理的研究是必須的。王華等［12］表達了653 bp 長的溶血素基因的部分片段。王海麗等［13］表達了溶血素編碼蛋白質中包含多個抗原表位的第230 ～593 氨基酸殘基區(qū)域的基因片段。吉利偉等［14］表達了基因長度約為1 200 bp 的溶血素片段，并進行了小鼠免疫保護試驗，結果是重組蛋白質的保護率為66.7%(10/15)。

本試驗應用分子生物學方法，用pET-32α(+)成功表達了豬鏈球菌2 型江蘇分離株SS2-1 的豬鏈球菌溶血素成熟蛋白，而且表達量較高，純化方便;經(jīng)試驗驗證，表達蛋白質與豬鏈球菌溶血素多抗呈陽性反應，對小鼠具有良好的免疫保護性。且表達蛋白質有一半存在于上清中，能很好地保持原有蛋白質的生物學活性，試驗也證明了此蛋白質具有溶血活性和細胞毒性。而且成熟蛋白對小鼠的免疫保護率(83.3%)也優(yōu)于部分長度蛋白質的免疫保護率(66.7%)［14］。溶血素成熟蛋白的獲得，為進一步研究SLY 致病機理和研制豬鏈球菌新型疫苗奠定了基礎。

我們曾嘗試將帶有信號肽序列的sly 全長基因構建于同一載體中，雖然也獲得表達，但表達量不高，且很不穩(wěn)定，其中的原因尚待進一步研究。

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