靳 容， 后 猛， 馬代夫， 謝世清， 李 強(qiáng)

(1.江蘇徐州甘薯研究中心，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘薯研究所，農(nóng)業(yè)部甘薯生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 徐州221131;2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，云南 昆明650201)

甘薯［Ipomoea batatas (L.)Lam.］是繼水稻、小麥、玉米之后的中國(guó)第四大糧食作物［1］。它富含人體必需的多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，保健價(jià)值很高，尤其是紅肉甘薯中含有大量的β-胡蘿卜素。作為維生素A 的重要合成前體，β-胡蘿卜素對(duì)預(yù)防夜盲癥有良好的效果，可有效改善婦女及兒童因夜盲癥導(dǎo)致的失明狀況［2-3］，具有十分重要的市場(chǎng)開發(fā)價(jià)值［4-5］。β-胡蘿卜素由多個(gè)基因共同控制合成［6］，并且與許多優(yōu)良性狀存在負(fù)相關(guān)［7-8］，傳統(tǒng)育種方法周期長(zhǎng)，直接影響到富含胡蘿卜素、綜合性狀優(yōu)良品種的選育效率。

1993 年Hall 等［9］提出利用分子標(biāo)記技術(shù)輔助育種，可有效提高育種效率。Ukoskit 等［10］較早地將這種方法引入甘薯育種，利用集群分離分析法(Bulked segregant analysis，BSA)［11］進(jìn)行甘薯抗根腐病基因的標(biāo)記分析。隨著分子標(biāo)記輔助育種方法在甘薯中的應(yīng)用，近年來研究人員開發(fā)了一些與甘薯重要性狀連鎖的分子標(biāo)記，尤以與抗病基因連鎖的分子標(biāo)記居多［12-14］。因?yàn)楦适肀旧泶嬖趶?fù)雜的自交不親和性，以及染色體組的高度雜合性，難以獲得純系［15］，所以甘薯上一般利用BSA 法構(gòu)建高密度遺傳連鎖圖譜。但是由于受到其他基因的干擾，利用BSA 法獲得的連鎖標(biāo)記的準(zhǔn)確度受到影響［16］，從而影響了甘薯遺傳圖譜的構(gòu)建及QTL 分析。

在缺少甘薯高飽和度遺傳圖譜的情況下，Mcharo 等［17］早在2004 年就利用AFLP 標(biāo)記建立模型，研究甘薯的干物率等性狀。隨后，Mcharo 等［18］和Douglas 等［19］分別利用與抗甘薯根結(jié)線蟲病(Southern root-knot nematode)和病毒病害(Sweet potato virus disease，SPVD)性狀連鎖的分子標(biāo)記建立Logistic 回歸模型，定性選育抗病甘薯品種。本試驗(yàn)通過篩選與甘薯高β-胡蘿卜素含量性狀相關(guān)的AFLP 分子標(biāo)記，試圖建立穩(wěn)定的Logistic 回歸模型，在無(wú)需測(cè)定甘薯塊根β-胡蘿卜素含量的情況下，特別是在甘薯早代育種過程中，可以快速、準(zhǔn)確地篩選出高β-胡蘿卜素含量的甘薯材料，為高β-胡蘿卜素甘薯品種(系)的選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料

建池與引物篩選材料:徐薯25(白肉、低胡蘿卜素含量甘薯品種)、徐薯22-5(紅肉、高胡蘿卜素含量甘薯品系)，及其雜交F1代分離材料共14 份。

模型驗(yàn)證材料:除建池雙親(徐薯25 和徐薯22-5)外，另外選擇4 個(gè)高β-胡蘿卜素桔紅肉甘薯品種(系)浙薯81、徐083228、徐070339、徐052701 和4 個(gè)低β-胡蘿卜素白肉甘薯品種(系)徐薯22、徐薯26、徐薯28、徐053601 共計(jì)10 個(gè)品種(系)作為L(zhǎng)ogistic 回歸模型驗(yàn)證材料。

1.2 樣品處理和基因組DNA 提取

在大田甘薯苗期，取所有試驗(yàn)用甘薯材料的頂部新鮮嫩葉3 ～5 片，在液氮中充分冷凍研磨成粉末，裝入1.5 ml 的離心管中，－80 ℃保存。按照李強(qiáng)等［20］方法提取基因組DNA，Nanodrop1000 微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)提取的DNA 濃度，終濃度用1 ×TE 溶液稀釋到50 ng/μl。0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取的DNA。

1.3 AFLP 分析

參照李強(qiáng)等［21］的AFLP 擴(kuò)增方法，首先用EcoR I 和Mse I 消化樣品DNA，然后用T4 連接酶16 ℃連接酶切產(chǎn)物12 h。將酶切連接產(chǎn)物用帶有1 個(gè)選擇性堿基的引物組合進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，得到的PCR 產(chǎn)物再用帶有3 個(gè)選擇性堿基的引物對(duì)其進(jìn)行AFLP 分析，PCR 反應(yīng)體積20.0 μl，其組分為TaqE buffer(+KCl)，1.25 U Taq DNA 聚合酶(TaqE)，0.2 mmol/L dNTP mix，1 μmol/L引物，3.5 μl 稀釋后的預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行PCR 反應(yīng)。本試驗(yàn)所用內(nèi)切酶、連接酶、TaqE 及dNTP 均購(gòu)自Fermentas 公司。雙酶切反應(yīng)、連接反應(yīng)、預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)和選擇擴(kuò)增反應(yīng)均在Cycler PCR 儀(BIO-RAD)上進(jìn)行。反應(yīng)所用接頭、預(yù)擴(kuò)增以及選擇擴(kuò)增引物均由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。

1.4 β-胡蘿卜素含量的測(cè)定

采用丙酮提取比色法［22］測(cè)定甘薯樣品中β-胡蘿卜素的含量(略有改動(dòng))。取健壯薯塊，沖洗晾曬或吸水紙擦干后，去皮縱切，四分法取樣。稱取薯塊樣品1.0 g，加入少量丙酮研磨，至提取液無(wú)色，定容至25.0 ml，3 000 r/min離心5 min，取上清液測(cè)定454 nm 波長(zhǎng)處光密度。同一甘薯樣品取樣3 次，取平均值。β-胡蘿卜含量按以下公式計(jì)算:

式中，CA:β-胡蘿卜素含量(單位為mg/g);A:丙酮液的消光度。

1.5 Logistic 回歸分析

分別根據(jù)EcoR I 和Mse I 酶切和接頭序列，各設(shè)計(jì)引物序列20 條，共計(jì)400 對(duì)引物組合，利用建池材料從400 對(duì)引物中篩選出5 對(duì)與高β-胡蘿卜素含量性狀相關(guān)的引物組合(表1)。利用篩選出的引物組合，對(duì)甘薯材料進(jìn)行AFLP 分析，使用SPSS Statistics 17.0 軟件構(gòu)建Logistic 回歸模型［23］，并檢測(cè)該模型中的每個(gè)材料是否符合預(yù)期結(jié)果。

表1 AFLP 分子標(biāo)記引物組合序列Table 1 Primer sequences of AFLP markers

構(gòu)建Logistic 回歸模型的過程中，首先對(duì)篩選出的AFLP 標(biāo)記進(jìn)行多態(tài)性賦值，出現(xiàn)條帶的記為1，沒有出現(xiàn)條帶的記為0，經(jīng)過列聯(lián)表整理后，用作構(gòu)建Logistic 回歸模型的自變量。篩選自變量采用向前法，即按照篩選出的標(biāo)記對(duì)β-胡蘿卜素合成基因的貢獻(xiàn)(P 值的大小)由小到大依次挑選，所有P 值均小于臨界值0.05，檢測(cè)該模型中分子標(biāo)記預(yù)測(cè)的每個(gè)材料是否符合胡蘿卜素含量高低劃分的結(jié)果。并用模型系數(shù)的混合檢驗(yàn)(Omnibus tests of model coefficients)、對(duì)數(shù)似然比檢驗(yàn)(Log-Likelihood ratio test)以及Hosmer-Lemeshow 檢驗(yàn)(Hosmer and Lemeshow test)分析評(píng)價(jià)該模型。

Logistic 回歸模型:表型(即胡蘿卜素含量高低)分組概率公式為:

其中P 為表型分組概率;β0為截距;β1、β2…βp為偏回歸系數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 β-胡蘿卜素含量

根據(jù)2008 和2009 年連續(xù)2 年對(duì)F1代分離群體β-胡蘿卜素含量的測(cè)定結(jié)果，選擇雜交后代中β-胡蘿卜素含量位于2 個(gè)極端的樣品，共計(jì)41 系(表2)。按照β-胡蘿卜素含量的不同，對(duì)選出的材料進(jìn)行分組，分為高β-胡蘿卜素含量組和低β-胡蘿卜素含量組，從表2中可以看出，高β-胡蘿卜素含量組共有19 個(gè)樣品，甘薯中β-胡蘿卜素含量的變化范圍為0.096 1 ～0.185 6 mg/g，肉色全部為橘紅色;低β-胡蘿卜素含量共有22個(gè)樣品，由于該組β-胡蘿卜素含量極低，多數(shù)樣品利用丙酮提取法無(wú)法測(cè)到，最高值也僅為0.003 3 mg/g，肉色為淡黃至白色。甘薯β-胡蘿卜素含量的高低與肉色有很大聯(lián)系，通常情況下，β-胡蘿卜素含量高的甘薯品種肉色為深黃色至橘紅色，含量低的肉色為白色至淡黃色［24］，白肉甘薯品種中的β-胡蘿卜素含量通常趨近于0［25-26］，這些都與本試驗(yàn)結(jié)果相一致。

2.2 Logistic 回歸結(jié)果

在理想的Logistic 模型中，所有高β-胡蘿卜素組的概率值應(yīng)趨向于0，所有低β-胡蘿卜素組的概率值應(yīng)趨向于1。本試驗(yàn)結(jié)果(表2)顯示，高β-胡蘿卜素組中z118 概率值≥0.50，z162 和z058 概率值分別為0.30 和0.20，其余樣品分組概率值均≤0.10，19 個(gè)樣品中有13 個(gè)樣品分組概率為0，樣品的平均分組概率P 為0.068;低β-胡蘿卜素組中z008 概率值為0，z105 概率值為0.60，其余樣品分組概率都≥0.90，22 個(gè)樣品中14 個(gè)樣品分組概率為1.00，樣品的平均分組概率P 為0.868。把分組概率P ＜0.50 的樣品歸為高β-胡蘿卜素組，分組概率P ＞0.50 的樣品歸為低β-胡蘿卜素組。依據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)，高β-胡蘿卜素組的z118 和低β-胡蘿卜素組中的z008 不符合分組，其余39 個(gè)樣品符合分組，正確度高達(dá)95.1%。

為了驗(yàn)證該模型擬合度，本試驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行了模型系數(shù)的混合檢驗(yàn)、對(duì)數(shù)似然比檢驗(yàn)以及Hosmer-Lemeshow 檢驗(yàn)。模型系數(shù)的混合檢驗(yàn)是針對(duì)步驟、模塊和模型開展模型系數(shù)的綜合性檢驗(yàn)。結(jié)果顯示，不論是步驟、模塊和模型的卡方值均大于顯著性水平0.05 的卡方臨界值，因此該Logistic 回歸模型通過檢驗(yàn)。

對(duì)數(shù)似然比檢驗(yàn)中，－2lgL 越小，說明自變量的作用越顯著，模型擬合效果越好。該Logistic 回歸分析中每一步的－2lgL 值都在不斷減小，隨著模型的逐步完善，－2lgL 從最初的39.444 減少到15.339，說明該模型的擬合效果不斷提高。作為補(bǔ)充和參照，本試驗(yàn)還對(duì)該模型進(jìn)行了Hosmer-Lemeshow 檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，高胡蘿卜素組的期望值(Expected)逐漸減少到0，與觀測(cè)值(Observed)趨于接近;低胡蘿卜素組的期望值逐漸增加到4，與觀測(cè)值也趨于接近。綜上所述，本試驗(yàn)構(gòu)建模型的整體擬合效果較好。

表2 F1 代分離群體表型分類Table 2 Phenotypic classification of F1 half-sibs based on β-carotene content of sweetpotato

2.3 Logistic 回歸模型可行性分析

為了進(jìn)一步分析Logistic 回歸模型在甘薯育種中可行性，根據(jù)胡蘿卜素含量結(jié)果，把驗(yàn)證用的10種胡蘿卜素品種(系)分成高胡蘿卜素品種(系)和低胡蘿卜素品種(系)進(jìn)行Logistic 回歸分析，供試樣品通過Logistic 回歸分析，所得分組概率如表3 所示。高β-胡蘿卜素組5 個(gè)樣品分組概率值均≤0.10，低β-胡蘿卜素組5 個(gè)樣品分組概率都≥0.90。供試材料分組概率全部符合預(yù)先表型分析，結(jié)果表明該Logistic 回歸模型可以用于高β-胡蘿卜素甘薯品種的分子標(biāo)記輔助選育。

表3 驗(yàn)證甘薯樣品表型分類Table 3 The verification of phenotypic classification for β-carotene content in sweetpotato samples

3 討論

目前，通過多個(gè)分子標(biāo)記建立統(tǒng)計(jì)模型來研究甘薯數(shù)量性狀的方法只有Discrimination 分析與Logistic 回歸分析，Logistic 回歸分析比Discrimination分析更加精準(zhǔn)，用到的分子標(biāo)記數(shù)目更少，應(yīng)用也更方便［27］。利用分子標(biāo)記輔助育種的方法有QTL 分析，但QTL 分析需要預(yù)先已知甘薯的遺傳圖譜［28-30］;其次，β-胡蘿卜素合成基因相關(guān)QTL 也有可能分布在甘薯白肉品種中［31］，因而這些QTL 不能直接應(yīng)用到甘薯高β-胡蘿卜素育種中;再者，構(gòu)建遺傳圖譜和QTL 分析要求建譜親本純度高［32］，且QTL 分析只適用于親本的分離群體，而使用多個(gè)分子標(biāo)記構(gòu)建的Logistic 統(tǒng)計(jì)模型則對(duì)樣品材料無(wú)特殊要求。

本研究利用5 個(gè)與高β-胡蘿卜素含量性狀相關(guān)的AFLP 分子標(biāo)記建立Logistic 回歸方程，檢驗(yàn)徐薯22-5 與徐薯25 的41 個(gè)甘薯雜交后代的β-胡蘿卜素含量高低是否符合預(yù)期的β-胡蘿卜素分組，僅2 個(gè)樣品不符合預(yù)期分組，正確率高達(dá)95.1%，能夠準(zhǔn)確預(yù)測(cè)大多數(shù)甘薯樣品中β-胡蘿卜素含量高低。如果將更多與β-胡蘿卜素合成相關(guān)的分子標(biāo)記引入該模型，其正確率完全能夠達(dá)到100%，使模型達(dá)到最優(yōu)水平。該模型不僅完全通過模型系數(shù)的混合檢驗(yàn)、對(duì)數(shù)似然比檢驗(yàn)以及Hosmer-Lemeshow 檢驗(yàn)，具有較高的擬合度，而且用于構(gòu)建模型的AFLP 分子標(biāo)記較之RAPD 和SSR 等分子標(biāo)記，其多態(tài)性高、穩(wěn)定性好［33］。10 個(gè)高(低)胡蘿卜素品種(系)全部通過該Logistic 回歸模型分析，充分證明了該模型的可靠性。

Delia 等［34］曾指出使用高效液相色譜(HPLC)分析紅肉甘薯品種中的類胡蘿卜素含量，其中β-胡蘿卜素含量最高，其他類胡蘿卜素組分含量極低，甚至可以忽略不計(jì)。因此，本研究測(cè)定甘薯β-胡蘿卜素含量的方法，不但簡(jiǎn)單易行，而且準(zhǔn)確度較高。試驗(yàn)中所挑選的甘薯樣品依據(jù)胡蘿卜素含量的高低呈雙峰分布，這樣不但易于分組，而且使得篩選出的同一個(gè)分子標(biāo)記在2 組樣品之間出現(xiàn)的條帶數(shù)目差異性大，優(yōu)化Logistic 模型。

由于不同生長(zhǎng)發(fā)育期，甘薯塊根所含β-胡蘿卜素含量也有一定的差異，一般表現(xiàn)為生長(zhǎng)后期β-胡蘿卜素含量高于中、前期［35-36］，所以傳統(tǒng)育種只有等到甘薯塊根成熟后，切開薯塊，然后通過肉眼觀察甘薯肉色或是測(cè)量β-胡蘿卜素含量，才能得知該材料是否屬于高β-胡蘿卜素甘薯品種。但是，這種傳統(tǒng)育種方法不但破壞甘薯薯塊，而且育種周期長(zhǎng)、育種速度緩慢。本試驗(yàn)在注重改善其他農(nóng)藝性狀的同時(shí)，結(jié)合分子標(biāo)記輔助育種，在甘薯早代育種過程，特別是在實(shí)生苗篩選中，通過田間早期地上部表現(xiàn)結(jié)合分子標(biāo)記手段，在不影響甘薯塊根正常生長(zhǎng)的情況，提前淘汰不符合育種目標(biāo)的個(gè)體，既減輕工作負(fù)擔(dān)，又提高育種的準(zhǔn)確性，從而縮短育種年限。

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