孫莎莎，范文來，*，徐 巖，李記明，，于 英

（1.教育部工業(yè)生物技術(shù)重點實驗室，江南大學(xué)釀酒科學(xué)與酶技術(shù)研究中心，釀造微生物與應(yīng)用酶學(xué)研究室，江蘇無錫214122；2.張裕集團公司技術(shù)中心，山東煙臺264001）

赤霞珠是世界著名的釀酒紅葡萄品種之一，以其易種植、適應(yīng)性強、著色與品質(zhì)良好、酒質(zhì)優(yōu)等特點，而受到葡萄酒生產(chǎn)者的熱愛[1]。赤霞珠也是我國主要的釀酒紅葡萄品種之一，我國葡萄種植區(qū)相對集中在氣候和土壤適宜的地區(qū)，形成了黃土高原、新疆、渤海灣和華北地區(qū)等著名的釀酒葡萄生產(chǎn)區(qū)域[2]。由于氣候、土壤、地質(zhì)等地域因素的影響，從而使不同產(chǎn)地的赤霞珠葡萄在香氣構(gòu)成上產(chǎn)生了差異[3]，最終影響葡萄酒的特性和品質(zhì)[4]，因此，研究不同產(chǎn)地葡萄的香氣成分特點對葡萄酒釀造具有重要指導(dǎo)意義。

目前，研究葡萄中揮發(fā)性香氣成分的方法主要有液液萃?。↙LE）、同時蒸餾萃?。⊿DE）、頂空固相微萃?。℉S-SPME）、攪拌棒吸附萃?。⊿BSE）等技術(shù)[5]，而利用HS-SPME及氣相色譜質(zhì)譜（GC-MS）分析葡萄中的芳香性成分，是葡萄分類、質(zhì)量控制以及了解葡萄香氣特點的重要手段[6-10]。國內(nèi)外對赤霞珠葡萄的研究取得了一定的成果，2010年Fan等[11]比較了赤霞珠在內(nèi)的四種釀酒葡萄中揮發(fā)性香氣成分的特點，2011年Forde等[12]研究了赤霞珠及其釀造的葡萄酒的揮發(fā)性成分和感官屬性間的關(guān)系，2013年Jiang等[13]對我國四個葡萄種植區(qū)的赤霞珠和蛇龍珠葡萄酒進行了比較研究，但是針對不同產(chǎn)地間赤霞珠葡萄香氣成分差異研究的報道較少。

本實驗主要采用HS-SPME和GC-MS分析新疆石河子、寧夏青銅峽、河北懷來和山東煙臺四個產(chǎn)地的赤霞珠葡萄果實中的揮發(fā)性香氣成分，并運用方差分析（ANOVA）和判別分析（DA）找到產(chǎn)地間具有顯著性差異的成分，為區(qū)分不同產(chǎn)地的赤霞珠葡萄提供理論依據(jù)，并為提高4個產(chǎn)地葡萄品質(zhì)及確定其釀造工藝提供指導(dǎo)性數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

2011年26個赤霞珠釀酒紅葡萄樣品（包括新疆石河子3個樣品、寧夏青銅峽16個樣品、山東煙臺5個樣品和河北懷來2個樣品） 均由張裕公司技術(shù)中心提供；乙酸乙酯（純度99%，CAS：141-78-6）、丁酸乙酯（純度99%，CAS：105-54-4）、3-甲基丁醛（純度97%，CAS：590-86-3）、1-己醇（純度99%，CAS：111-27-3）、3-甲基丁醇（純度99%，CAS：123-51-3）、順-3-己烯-1-醇（純度99%，CAS：928-96-1）、1-辛烯-3-醇（純度98%，CAS：3391-86-4）、2-乙基-1-己醇（純度99%，CAS：104-76-7）、苯甲醛（純度99%，CAS：100-52-7）、1-辛醇（純度98%，CAS：111-87-5）、順，反-2，6-壬二烯醛（純度95%，CAS：557-48-2）、4-萜品醇（純度99%，CAS：20126-76-5）、里那醇（純度98%，CAS：78-70-6）、苯乙醛（純度97%，CAS：122-78-1）、α-松油醇（純度98%，CAS：10482-56-1）、β-大馬酮（純度98%，CAS：23726-93-4）、己酸（純度99%，CAS：142-62-1）、苯甲醇（純度99%，CAS：100-51-6）、苯酚（純度98%，CAS：108-95-2）、順-2-戊烯-1-醇（純度95%，CAS：1576-95-0）、反-2-庚烯醛（純度97%，CAS：18829-55-5）、反-2-己烯-1-醇（純度96%，CAS：928-95-0）、辛醛（純度99%，CAS：124-13-0）、反-2-己烯醛（純度99%，CAS：6728-26-3）、1-戊醇（純度99%，CAS：71-41-0）、水楊酸甲酯（純度99%，CAS：119-36-8）、p-傘花烴（純度95%，CAS：99-87-6）、d-檸檬油精（純度96%，CAS：138-86-3）、2-庚醇（純度99%，CAS：543-49-7）、壬醛（純度97%，CAS：124-19-6）、乙酸（純度98%，CAS：64-19-7）、糠醛（純度96%，CAS：98-01-1）、反，反-2，4-庚二烯醛（純度96%，CAS：5910-85-0）、丁二酸二乙酯（純度98%，CAS：123-25-1）、順-香葉基丙酮（純度97%，CAS：689-67-8）、β-苯乙醇（純度98%，CAS：60-12-8）、壬酸（純度98%，CAS：112-05-0）和乙醇（液相色譜純） 均購自Sigma-A ldrich公司；2-辛醇（純度96%，CAS：6169-06-8） 購自Fluka公司；辛酸（純度98%，CAS：124-07-2） 購自吳江慈云香料香精有限公司；己醛（純度98%，CAS：66-25-1）、癸醛（純度99%，CAS：112-31-2） 購自北京北大正元科技有限公司。

6890N-5975型氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Agilent公司；50μm/30μm CAR/DVB/PDMS（2cm）萃取頭美國Supelco公司；Autosamp ler自動進樣系統(tǒng) 德國Gerstel公司；Avallyi J-E高速離心機 美國BECKMAN公司；AS2060B型超聲波清洗器 天津Autoscience公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品預(yù)處理 取完全成熟的葡萄樣品用液氮速凍，于-20℃保藏。實驗時稱取冷凍儲藏的葡萄樣品50g，室溫解凍3h，去梗放入塑封袋中，稱重，加入葡萄1%重量的無水CaCl2，破碎榨汁（籽不破壞），去籽后將果汁和果皮移入50m L小燒杯中冰水浴（0℃）超聲浸取20m in，4℃下5000r/min離心10m in，量取8m L葡萄汁加入頂空瓶中，加2.4g NaCl和4μL 2-辛醇內(nèi)標（濃度為10.76mg/L），蓋上頂空瓶蓋，用于GC-MS檢測。

1.2.2 GC-MS條件

1.2.2.1 色譜條件 色譜柱：DB-FFAP（60m×0.25mm×0.25μm，Agilent）；升溫程序：50℃保持1m in，以4℃/m in升至230℃，保持5m in；載氣（He）流速2m L/m in；不分流進樣。

1.2.2.2 質(zhì)譜條件 電子轟擊（EI）離子源；電子能量70eV；離子源溫度230℃；質(zhì)量掃描范圍m/z 35～350。1.2.3 HS-SPME萃取條件 采用Fan等的方法[11]，50μm/30μm CAR/DVB/PDMS（2cm）萃取頭（Supelco，Inc.，Bellefonte，PA），預(yù)熱5m in，60℃下對揮發(fā)性成分萃取45m in。

1.2.4 揮發(fā)性成分定性與定量

1.2.4.1 物質(zhì)定性 有標準品的化合物，采用標準品定性。未知化合物的定性采用將其圖譜與NIST 05質(zhì)譜庫（107K compounds）和W iley Library（320K compounds，version 6.0）相比較，保留匹配度大于800（最高值為1000）的物質(zhì)作為化合物定性鑒定結(jié)果。

1.2.4.2 物質(zhì)定量 每種待測物質(zhì)分別對應(yīng)于內(nèi)標作標準曲線，經(jīng)過GC-MS檢測后，將待測物質(zhì)與內(nèi)標的相對峰面積之比代入相應(yīng)的標準曲線方程，計算出待測物質(zhì)的含量。采用選擇離子（SIM）計算每種待測物質(zhì)的峰面積。

1.2.5 統(tǒng)計分析 本實驗用SPSS 19軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，通過ANOVA分析出不同產(chǎn)地葡萄中有明顯差異的揮發(fā)性成分，并運用DA對葡萄產(chǎn)地進行判別。

2 結(jié)果與討論

2.1 赤霞珠葡萄中揮發(fā)性成分定量結(jié)果分析

利用頂空固相微萃取法提取赤霞珠葡萄中的香氣成分，進行GC-MS分析，共定性定量了47種化合物（見表1），其中包括4種酯類、8種醛類、8種醇類、6種芳香族化合物、3種揮發(fā)性有機酸、10種萜烯類化合物、8種C6化合物，不同產(chǎn)地的赤霞珠葡萄中檢測出的香氣成分種類基本相同。根據(jù)定量結(jié)果，反，反-2，4-庚二烯醛、順，反-2，6-壬二烯醛、1-辛醇、1-戊醇、辛酸、d-檸檬油精、β-大馬酮、1-己醇、己酸、己醛、反-2-己烯醛、反，反-2，4-己二烯醛、2-己烯酸在四個產(chǎn)地的赤霞珠中有較高的濃度（達到mg/L），是赤霞珠中主要的風味物質(zhì)。

總體上，在不同產(chǎn)地的赤霞珠葡萄中，各類化合物的總含量各有特點。新疆石河子產(chǎn)地萜烯類化合物含量偏高，寧夏青銅峽含有較多酯類、醇類，山東煙臺產(chǎn)地醛類、C6化合物含量較高，而河北懷來揮發(fā)性有機酸濃度較高。總體上，寧夏青銅峽產(chǎn)地的揮發(fā)性成分總含量是偏高于其他產(chǎn)區(qū)的，推測與寧夏產(chǎn)區(qū)優(yōu)越的環(huán)境條件有關(guān)，其自然條件與波爾多相媲美[14]，氣候干燥，晝夜溫差大，光照充足，土質(zhì)原始，土壤有機質(zhì)含量高，砂礫結(jié)合型土質(zhì)透氣性極佳，因此葡萄香氣發(fā)育完全。

2.2 四個產(chǎn)地赤霞珠葡萄揮發(fā)性成分方差分析

不同產(chǎn)地的赤霞珠葡萄中檢測出的香氣骨架基本一致，但由于氣候、土壤、地質(zhì)等地域因素的影響，不同產(chǎn)地的葡萄在香氣成分含量上產(chǎn)生了差異[15]。對四個產(chǎn)地赤霞珠葡萄樣品進行方差分析（見表1），可以看出，有8種香氣物質(zhì)含量在產(chǎn)地間具有顯著差異，包括1種醛類（反-2-庚烯醛），1種醇類（順-2-戊烯-1-醇），2種芳香族化合物（苯酚、苯甲醇），1種揮發(fā)性有機酸（辛酸），1種萜烯類化合物（β-大馬酮），2種C6化合物（己醛、反-2-己烯醛），而定量的4種酯類化合物均沒有顯著性差異。

續(xù)表

顯著性差異成分中含量較高的香氣成分包括辛酸、β-大馬酮、己醛和反-2-己烯醛。

辛酸在河北懷來赤霞珠中的含量顯著高于新疆石河子產(chǎn)地。辛酸在赤霞珠葡萄中的含量較高，不同產(chǎn)地赤霞珠中辛酸的濃度范圍在0.36～2.33mg/L。辛酸呈現(xiàn)干酪氣味[11]，酸類物質(zhì)是葡萄中酸臭氣味的主要來源，主要是在漿果轉(zhuǎn)色前由植株綠色部分的呼吸作用產(chǎn)生[16]。

β-大馬酮（糖果香[11]）在石河子地區(qū)的赤霞珠中葡萄中含量顯著高于煙臺和懷來，由表1可見不同產(chǎn)地間的10種萜烯類化合物中，只有β-大馬酮的含量具有顯著性差異，但從總體上看，不同產(chǎn)地間葡萄的萜烯類化合物的構(gòu)成差別不大。已有研究顯示，葡萄中萜烯類化合物的種類受葡萄的生長區(qū)域影響小，同一品種不同產(chǎn)區(qū)的葡萄，萜烯類化合物的組成非常相近，實驗結(jié)果與這一結(jié)論相似[17]。

己醛和反-2-己烯醛兩種高濃度的C6化合物，在不同產(chǎn)地之間有顯著差異，主要表現(xiàn)在石河子和煙臺產(chǎn)地的己醛顯著高于青銅峽和懷來產(chǎn)地，煙臺產(chǎn)地的反-2-己烯醛含量顯著高于懷來產(chǎn)地。葡萄中的C6化合物主要貢獻青草、樹葉氣味[11]，己醛和反-2-己烯醛在不同產(chǎn)地赤霞珠中含量分別高達2.63mg/L和6.73mg/L，是葡萄中重要的風味化合物[18]。

較低濃度的顯著性差異成分包括順-2-戊烯-1-醇，反-2-庚烯醛、苯酚和苯甲醇。

順-2-戊烯-1-醇（呈蘑菇氣味[19]），在新疆石河子和河北懷來地區(qū)的赤霞珠葡萄中含量顯著高于寧夏青銅峽，而反-2-庚烯醛（呈現(xiàn)脂肪氣味，青草香[20]），在河北懷來地區(qū)的含量顯著高于其他產(chǎn)地。芳香族化合物中苯酚和苯甲醇（分別呈酚臭和花香[11]）含量有顯著差異，山東煙臺產(chǎn)地苯酚含量顯著高于其他產(chǎn)地，且煙臺的苯甲醇含量也顯著高于河北懷來。

可見，新疆石河子地區(qū)赤霞珠風味物質(zhì)特點是具有較高濃度的己醛和β-大馬酮，寧夏青銅峽含有較低濃度的順-2-戊烯-1-醇、己醛，山東煙臺有較高濃度的苯甲醇、苯酚、己醛和反-2-己烯醛，而河北懷來有較高濃度的反-2-庚烯醛、辛酸。因此，不同產(chǎn)地赤霞珠主要風味物質(zhì)特征在于：石河子產(chǎn)地具有較高濃度的β-大馬酮，青銅峽產(chǎn)地具有較低濃度的己醛，煙臺產(chǎn)地的反-2-己烯醛含量比較高，而懷來產(chǎn)地的辛酸濃度比較高。

2.3 判別分析

通過判別分析區(qū)分四個赤霞珠葡萄產(chǎn)地，判別分析證明，通過方差分析得到的8種成分可以將已有赤霞珠葡萄的產(chǎn)地正確的區(qū)分開。

將方差分析得到的顯著性差異成分作為判別分析成分，所得的標準化典型判別函數(shù)系數(shù)見表2，判別分析得到三個典型判別函數(shù)，前兩個函數(shù)的累計方差貢獻率為88.1%。

表2 4個產(chǎn)地赤霞珠葡萄中香氣物質(zhì)判別函數(shù)的標準系數(shù)Table2 Standardized canonical discriminant function coefficients for aroma compounds in grapes

從表3可知，利用篩選出的變量可以對25個葡萄樣品的產(chǎn)地進行100%的正確分類，交叉驗證分組案例中有88.5%的樣品進行了正確分類。圖1為不同產(chǎn)地赤霞珠葡萄的判別分析結(jié)果，各樣品都比較緊密的圍繞在質(zhì)心周圍，可以看出山東煙臺、新疆石河子、寧夏青銅峽與河北懷來四個產(chǎn)地的葡萄都可以較好的區(qū)分。

可見通過方差分析的到的顯著性差異成分具有很好的代表性，為不同產(chǎn)地間赤霞株葡萄的鑒別提供了理論依據(jù)。

3 結(jié)論

本文采用HS-SPME技術(shù)結(jié)合GC-MS分析技術(shù)測定了張裕四大產(chǎn)地的赤霞珠釀酒紅葡萄樣品，定量了47種化合物，其中包括4種酯類、8種醛類、8種醇類、6種芳香族化合物、3種揮發(fā)性有機酸、10種萜烯類化合物、8種C6化合物，其中寧夏青銅峽產(chǎn)地測得的香氣成分總含量最高，不同產(chǎn)地間各類香氣物質(zhì)含量各有特點。

圖1 赤霞珠葡萄產(chǎn)地判別函數(shù)圖Fig.1 Plotof discriminant functions

基于對張裕四大產(chǎn)地赤霞珠葡萄揮發(fā)性成分檢測結(jié)果，通過方差分析從47種成分中篩選出了反-2-庚烯醛、順-2-戊烯-1-醇、苯酚、苯甲醇、辛酸、β-大馬酮、己醛、反-2-己烯醛，這8種具有顯著性差異的成分。不同產(chǎn)地赤霞珠主要風味物質(zhì)特征在于：新疆石河子產(chǎn)地具有較高濃度的β-大馬酮，寧夏青銅峽具有較低濃度的己醛，山東煙臺產(chǎn)地反-2-己烯醛含量比較高，而河北懷來產(chǎn)地的辛酸濃度比較高。

以這8種成分作為判別分析成分，進而通過判別分析對葡萄樣品的產(chǎn)地進行了產(chǎn)地判別。結(jié)果表明，產(chǎn)地判別的準確率可以達到100%，交叉驗證準確率達到88.5%，比較客觀的反映了樣品的真實情況，充分說明這些成分具有產(chǎn)地特征性，可以通過比較香氣成分對四個產(chǎn)區(qū)的赤霞珠進行區(qū)分，從而為其產(chǎn)地鑒定提供了理論依據(jù)。而要建立更具應(yīng)用性與準確性的產(chǎn)地判別模型，還需要增大樣本量獲得更多的信息進行進一步的研究。

表3 判別分析分類結(jié)果a，cTable3 Classification results of DAa，c

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