李紫薇，劉 偉，張 藝，劉 楓

(伊犁師范學(xué)院化學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，新疆伊寧835000)

薰衣草系唇形科植物，為多年生亞灌木，是珍貴的中藥材和食品香料［1］。薰衣草被維吾爾醫(yī)用于治療胸腹脹滿、感冒咳嗽、頭暈頭痛、心悸氣短、關(guān)節(jié)骨痛，為中華人民共和國衛(wèi)生部《藥品標(biāo)準》維吾爾藥分冊的收載品種［1］。薰衣草富含揮發(fā)油、香豆素、單寧、類黃酮等，具有鎮(zhèn)靜［2-3］、抗菌、抗脂質(zhì)過氧化、降脂肪［4］、神經(jīng)保護［5］等功效。吳霞等［6-7］對薰衣草成分進行了系統(tǒng)的研究，已從中分離得到了7個黃酮類化合物。黃酮類化合物具有良好的抗氧化能力［8］，具有增強機體免疫力、防治心腦血管疾病及抗腫瘤等功能［9-11］。研究薰衣草黃酮的提取工藝對薰衣草藥用價值的開發(fā)與利用具有重要意義。微波提取法具有選擇性高、操作簡單、揮發(fā)性成分提取效率高等優(yōu)點［12-15］。目前關(guān)于薰衣草總黃酮微波輔助提取的研究未見報道。本實驗以乙醇為溶劑，對薰衣草中總黃酮的微波輔助提取工藝進行了優(yōu)化，并考察了提取物的抗氧化活性。旨在為薰衣草中黃酮類化合物的提取及綜合利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

薰衣草 超低溫冷凍儲藏，產(chǎn)自伊犁;實驗用水 蒸餾水;蕓香葉苷(蘆丁) 上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司，AR;1，1-二苯基-2-苦肼基自由基(DPPH) 化成工業(yè)開發(fā)有限公司，AR;三羥甲基胺基甲烷(Tris) 北京雙環(huán)化學(xué)試劑廠，AR;抗壞血酸 天津光友精細化工研究所，AR;亞油酸 美國，AR;水楊酸 成都化學(xué)試劑廠，AR;鄰苯三酚、無水乙醇 成都市科龍化工試劑廠，AR;焦性沒食子酸天津福晨化學(xué)試劑廠，AR;鹽酸 天津市化學(xué)試劑三廠，AR;亞硝酸鈉 西安化學(xué)試劑廠，AR;蘆丁標(biāo)準溶液 準確稱取0.0200g蘆丁標(biāo)準品，以體積分數(shù)60%的乙醇溶解，定容至100mL容量瓶，得0.200mg/mL的蘆丁標(biāo)準液。

XH-300A祥鵠電腦微波超聲波組合合成/萃取儀 北京祥鵠科技發(fā)展有限公司;RE-52系列旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、SHZ-Ⅲ循環(huán)水真空泵 上海亞榮生化儀器廠;723PC可見分光光度計 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司;FW-80高速萬能粉碎機 北京市永光明醫(yī)療儀器廠;KQ-250DB數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;F2104N分析天平 上海儀器制造廠;VOS-60A真空干燥箱 上海施都凱儀器設(shè)備有限公司;TGL-16C飛鴿牌高速臺式離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 薰衣草總黃酮的提取 樣品處理:薰衣草干花(超低溫冷凍儲藏)陰干、粉碎，過40目篩備用。稱取薰衣草花干粉2.0000g，用體積分數(shù)為45%乙醇(料液比1∶25)，功率500W，微波時間25m in，抽濾，蒸餾水定容于250m L，得到薰衣草黃酮的粗提液，備用(抗氧化活性實驗)。

1.2.2 蘆丁標(biāo)準曲線的繪制［16-17］分別移取0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、7.00、8.00m L的蘆丁標(biāo)準液于9個25m L比色管中，各加1.0m L 50mg/m L的 NaNO2溶液，搖勻后靜置6m in，再各加1.0m L 100mg/m L的A l(NO3)3溶液，搖勻后靜置6min，繼續(xù)各加入10.00m L 40mg/m L的NaOH溶液，用體積分數(shù)為60%的乙醇稀釋到刻度，靜置15m in。在510nm處測定吸光度(A)，以濃度C(mg/m L)為橫坐標(biāo)，A為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準曲線，其線性回歸方程為: A=0.01111+18.4554C，R=0.9998，線性范圍0.00～0.07mg/m L。

1.2.3 總黃酮含量的測定 移取1.00m L供試液于25m L容量瓶中，按“1.2.2”項測定吸光度，得供試品中總黃酮的質(zhì)量濃度，計算總黃酮提取率。

1.2.4 微波輔助提取薰衣草總黃酮的工藝條件優(yōu)化

1.2.4.1 料液比對提取率的影響 準確稱取薰衣草花干粉2.0000g，平行5份，分別置100m L三頸燒瓶中，以體積分數(shù)為60%乙醇，微波提取時間10min，微波功率400W，料液比分別為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30時提取薰衣草花干粉中的總黃酮，計算提取率。

1.2.4.2 功率對提取率的影響 準確稱取薰衣草花干粉2.0000g，平行5份，分別置100m L三頸燒瓶中，乙醇體積分數(shù)60%，微波提取時間10m in，料液比1∶20，微波功率分別為200、300、400、500、600W時提取薰衣草花干粉中的總黃酮，計算提取率。

1.2.4.3 微波處理時間對提取率的影響 準確稱取薰衣草花干粉2.0000g，平行5份，分別置100m L三頸燒瓶中，體積分數(shù)60%乙醇，料液比為1∶20，微波功率為400W，微波時間分別為5、10、15、20、25、30m in時提取薰衣草花干粉中的總黃酮，計算提取率。

1.2.4.4 乙醇體積分數(shù)對提取率的影響 準確稱取薰衣草花干粉2.0000g，平行5份，分別置100m L三頸燒瓶中，微波提取時間10m in，料液比1∶20，微波功率400W，乙醇體積分數(shù)15%、20%、30%、45%、60%、75%時提取薰衣草花干粉中的總黃酮，計算提取率。

1.2.4.5 正交實驗設(shè)計確定最佳提取工藝 正交實驗因素水平表如表1所示。

表1 L9(34)正交實驗因素水平表Table1 Factors and levels of orthogonal test L9(34)

1.2.5 抗氧化能力的測定

1.2.5.1 樣品預(yù)處理 薰衣草干花粉→微波輔助溶劑提取→抽濾→提取液→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮→濃縮液→冷凍→干燥→浸膏狀。

1.2.5.2 薰衣草花醇提物對羥基自由基的清除作用

配制 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0mg/m L樣品水溶液及相應(yīng)濃度的VC水溶液，避光保存。取 1.00m L 4.5mmol/L FeSO4，加 1.00m L 4.5mmol/L水楊酸-乙醇溶液，1.00m L待測溶液，1.00m L 4.4mmol/L H2O2。37℃水浴中反應(yīng)0.5h，以蒸餾水作參比，在510nm處測吸光度。以蒸餾水代替H2O2作為待測溶液的本底吸光度。按式(1)計算·OH清除率:

式中，A0:1.00m L FeSO4+1m L水楊酸-乙醇溶液+1.00m L蒸餾水+1m L H2O2;AX:1.00m L FeSO4+1m L水楊酸-乙醇溶液 +1.00m L樣品溶液 +1m L H2O2;AX0:1.00m L FeSO4+1m L水楊酸-乙醇溶液+1.00m L樣品溶液+1m L蒸餾水。

1.2.5.3 薰衣草花醇提物對DPPH·的清除作用 在2.00m L樣品溶液中，加入2×10-4mol/L的DPPH溶液2.00m L，搖勻后，在室溫黑暗處放置30m in。以無水乙醇作參比，測定517nm處的吸光度(Ai)。同時，測定樣品溶液2.00m L與無水乙醇2.00m L混合液在515nm處的吸光度(Aj)，再測定2.00m L DPPH溶液與2.00m L無水乙醇在517nm處的吸光度(A0)。按式(2)計算清除率:

1.2.5.4 薰衣草花醇提物對超氧陰離子自由基的清除作用 取3.00m L Tris-HCl緩沖液(pH8.2)，加入0.50m L樣品溶液，30℃水浴保溫 20m in后加入3.00m L 7mmol/L鄰苯三酚，反應(yīng)240s后加入1.00m L濃HCl終止反應(yīng)，420nm處測吸光度。按式(1)計算O·清除率。式中，A0:3.00m L Tris-HCl+0.50m L蒸餾水+3m L鄰苯三酚+1.00m L HCl;AX:3.00m L Tris-HCl+0.50m L樣品溶液 +3m L鄰苯三酚 +1.00m L HCl;AXO:3.00m L Tris-HCl+0.50m L樣品溶液+3m L蒸餾水+1.00m L HCl。

1.2.5.5 薰衣草花醇提物抑制亞油酸的過氧化作用 在10m L比色試管中分別加入1.00m L 25mg/m L亞油酸、2.00m L 0.2mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.0)，1.00m L蒸餾水、1.00m L樣液，反應(yīng)液混合均勻，37℃避光恒溫培養(yǎng)。每隔24h，在10m L具塞試管中分別加入0.10m L反應(yīng)混合液、4.70m L體積分數(shù)為75%乙醇、0.10m L 0.3mg/m L硫氰酸胺、0.10m L 20mmol/L硫酸亞鐵溶液，準確反應(yīng)3m in后，以蒸餾水為空白，在500nm測定吸光度。每隔24h在500nm處測定其吸光度值，空白對照以乙醇代替抗氧化劑。按式(3)計算抑制率。

1.2.5.6 薰衣草花醇提物的還原力測定實驗 各取VC、樣品溶液2.50m L，加入0.2mol/L磷酸鈉緩沖溶液(pH6.6)2.5m L和 10mg/m L鐵氰化鉀溶液2.50m L，將混合物在50℃保溫20m in，加入2.50m L 0.1g/m L三氯乙酸之后，離心10min(650 r/m in)，取上層液體5.00m L，加入5.00m L去離子水和 1.00m L 1mg/m L氯化鐵，混合均勻，在700nm下測定吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 微波輔助萃取薰衣草總黃酮

2.2.1 單因素實驗 按“1.2.4”項，采用單因素實驗方法考察料液比、微波功率、微波處理時間、乙醇體積分數(shù)對薰衣草總黃酮得率的影響。結(jié)果表明，料液比1∶20，微波功率為400W、微波處理20m in、乙醇體積分數(shù)為30%時提取效果較好，可以獲得6.82%的提取率。

2.2.2 正交實驗 在單因素實驗的基礎(chǔ)上做正交實驗L9(34)。以提取率作為考察指標(biāo)，確定最佳提取條件，結(jié)果見表2。最佳提取條件為:乙醇體積分數(shù)45%、料液比1∶25、微波功率500W、微波時間25m in。對表2的結(jié)果進行方差分析，各因素對總黃酮提取效果的影響依次為:微波功率＞料液比＞乙醇體積分數(shù)＞微波時間。

表2 L9(34)正交實驗結(jié)果表Table2 Result of orthogonal test L9(34)of extraction condition

2.2 微波輔助提取物的抗氧化活性實驗

2.2.1 提取物對羥基自由基的清除作用 以VC為陽性對照，測定薰衣草總黃酮提取物對·OH的清除率(圖1)。薰衣草總黃酮提取物質(zhì)量濃度在1.0～ 10.0mg/m L范圍內(nèi)，其對·OH的清除率隨提取物質(zhì)量濃度的升高而增加。10.0mg/m L提取物對羥基自由基的清除率可達到75.8%，相當(dāng)于VC的89.7%。

圖1 醇提物對·OH的清除作用Fig.1 ·OH scavenging rate of ethanol extracts

2.2.2 提取物對DPPH·的清除作用 以VC為陽性對照，測定薰衣草黃酮提取物對DPPH·的清除率(圖2)。薰衣草黃酮提取物對DPPH·的清除能力隨濃度升高而增強。提取物濃度為10.0mg/m L時，對DPPH·清除率是87.7%，相當(dāng)于VC的91.5%。

圖2 醇提物對DPPH·的清除作用Fig.2 DPPH·scavenging effect of ethanol extracts

2.2.3 提取物對超氧陰離子自由基的清除作用 不同濃度薰衣草黃酮提取物對超氧陰離子的清除能力見圖3。在鄰苯三酚自氧化體系中，薰衣草黃酮提取物對超氧陰離子具有一定的清除能力，并隨濃度的增大而有所增強。10.0mg/m L提取物對超氧陰離子自由基的清除率可達到68.6%，相當(dāng)于VC的74.5%。

圖3 醇提物對O·清除作用Fig.3 The O·scavenging effect of ethanol extracts

2.2.4 提取物對亞油酸的抗氧化作用 采用亞油酸體系測定薰衣草黃酮提取物的抗氧化能力，結(jié)果見圖4。薰衣草黃酮提取物抑制亞油酸過氧化能力隨濃度升高而增強。在9.0mg/m L時，提取物抑制亞油酸氧化的抑制率為74.1%，相當(dāng)于VC的81.3%。

圖4 醇提物抑制亞油酸過氧化作用Fig.4 Anti-oxidant effect for lindeic acid

為了研究薰衣草黃酮提取物抑制亞油酸氧化能力的穩(wěn)定性，選取5.0mg/m L濃度的提取物考察其在7d內(nèi)抑制亞油酸過氧化能力的變化情況。如圖5所示，不同提取物抑制亞油酸氧化能力隨著時間的延長呈下降趨勢，在第7d時仍具有一定的抗氧化能力。

圖5 時間對抑制亞油酸過氧化作用影響Fig.5 Effect of time on anti-oxidant for lindeic acid

2.2.5 提取物的還原力測定實驗 結(jié)果如圖6所示，薰衣草總黃酮粗提物和VC的還原能力均隨濃度的升高而增加。薰衣草總黃酮粗提物還原能力較強。在濃度較高時，薰衣草總黃酮和 VC的還原能力相當(dāng)。

圖6 還原能力測定實驗結(jié)果Fig.6 Reductive ability test results

3 結(jié)論

實驗研究了微波輔助提取薰衣草總黃酮的方法，確定了最佳提取條件，采用5種評價體系研究了提取物的抗氧化活性。微波輔助法對薰衣草總黃酮有較好的提取效果。最佳工藝條件是:乙醇體積分數(shù)45%、料液比1∶25、微波功率500W、微波時間25m in，提取率可以達到8.16%。薰衣草總黃酮具有較強的抗氧化性，作為多功能的抗氧化劑，應(yīng)用前景廣闊。實驗結(jié)果為薰衣草的有效成分的研究奠定了良好的基礎(chǔ)。

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