湯燕姍，賴鐘雄

(福建農(nóng)林大學(xué) 園藝植物生物工程研究所，福建 福州 350002)

白桃皮白、味濃、肉細(xì)、甜略有酸味，耐儲(chǔ)運(yùn)，可鮮食，亦可做桃罐頭，深受廣大消費(fèi)者的歡迎。桃作為一種木本果樹，傳統(tǒng)育種周期長(zhǎng)，易受自然災(zāi)害影響［1］。組織培養(yǎng)可以克服以上的這些缺點(diǎn)，為加快桃樹的育種工作帶來許多方便。胚培養(yǎng)是桃組培的主要方式之一［2－10］，20 世紀(jì)40 年代起胚培養(yǎng)技術(shù)開始廣泛應(yīng)用于果樹育種。目前，胚培養(yǎng)在克服桃遠(yuǎn)緣雜交育種胚的早期敗育、胚挽救、砧木快繁等研究領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用［11－13］，而且借助于胚培養(yǎng)技術(shù)可以獲得優(yōu)良的特早熟品種［14］。目前桃轉(zhuǎn)基因的困難還較大，主要原因在于高效穩(wěn)定的再生體系還未完全建立(存在莖尖枯死等問題［15］)，而利用成年材料(與母本一致的)做為外植體進(jìn)行再生體系建立難度則更大，因此用胚做材料也是一種較為現(xiàn)實(shí)的選擇。文獻(xiàn)中關(guān)于桃離體培養(yǎng)的報(bào)道多以下胚軸、枝條、葉片，未成熟的胚，莖尖等為外植體進(jìn)行研究為主［16－20］，對(duì)桃成熟胚培養(yǎng)研究的報(bào)道較少。本試驗(yàn)對(duì)白桃成熟胚試管苗培養(yǎng)進(jìn)行研究，以期為建立高頻穩(wěn)定的再生體系提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 取材

以白桃成熟的種子為材料(2010 年6 月取自福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院果樹實(shí)驗(yàn)基地)。

1.2 培養(yǎng)條件

光照強(qiáng)度 1 500 lx，光照時(shí)間 12 h/d，培養(yǎng)溫度(25 ±2)℃，培養(yǎng)基 pH 值 5.8。

1.3 方法

1.3.1 白桃成熟胚無菌萌發(fā) 取白桃硬核期的種子，用體積分?jǐn)?shù)為75%酒精(30 s)+1 g/LHgCl2(5 min)+無菌水(24 h)+1 g/LHgCl2(3 min)方法在超凈工作臺(tái)上對(duì)桃種子進(jìn)行消毒，然后用無菌水沖洗5 次，去種皮后，接種于MS 培養(yǎng)基上，進(jìn)行無菌萌發(fā)。

1.3.2 不同激素濃度對(duì)白桃試管苗增殖的影響 待胚萌發(fā)后將胚苗切成1.5 ～2.0 cm 的莖段，接到不同的增殖培養(yǎng)基上，30 d 后觀察各組試管苗增殖情況。以MS 為基本培養(yǎng)基，附加蔗糖30.0 g/L+瓊脂6 g/L，分別添加了 IBA、6 － BA 等 2 種激素，IBA 質(zhì)量濃度分別為 0，0.2，0.4 mg/L，6 －BA 質(zhì)量濃度分別為0，0.5，1.0 mg/L，進(jìn)行二因素完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，組成 9 種組合。

1.3.3 不同因素對(duì)白桃試管苗生根的影響 當(dāng)新梢生長(zhǎng)得比較健壯時(shí)，就可以進(jìn)行誘導(dǎo)生根。將試管苗切成1.5 ～2.0 cm 的莖段接到不同的生根培養(yǎng)基上，30 d 后觀察各組試管苗生根的情況?？紤]3 個(gè)因素:①基本培養(yǎng)基(MS、1/2MS、1/4MS)②IBA(0.0，0.3，0.5 mg/L)③NAA(0，0.2，0.4 mg/L)，進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)。

1.4 數(shù)據(jù)的記錄與統(tǒng)計(jì)

每種處理接15 瓶，每瓶接1 個(gè)(1 株)，重復(fù)3 次。接種后每隔5 d 觀察其增殖及生根情況。第30天統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，用DPS 軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 白桃成熟胚無菌萌發(fā)

取白桃硬核期的種子，表面消毒后接種于MS 培養(yǎng)基上進(jìn)行無菌萌發(fā)，30 d 后，萌發(fā)率達(dá)86.67%(圖版 I－A)。

2.2 不同質(zhì)量濃度激素對(duì)白桃試管苗增殖的影響

待胚萌發(fā)后接種在增殖培養(yǎng)基上試管苗頂芽或側(cè)芽于在接種5 ～7 d 后開始萌動(dòng)抽梢，10 d 后開始展葉，30 d 觀察其增殖情況(表1)。從表1 中可以看出，以M3 培養(yǎng)基的的增殖效果最好，試管苗增殖系數(shù)最大，且試管苗的生長(zhǎng)健壯，顏色深綠(圖版I －B)。在培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)6 －BA 達(dá)1.0 mg/L時(shí)，雖然其增殖系數(shù)會(huì)比較大，但當(dāng)IBA 質(zhì)量濃度進(jìn)一步上升時(shí)，植株的葉片比較短且比較容易畸形、卷曲(圖版I－C)，當(dāng)6 －BA 為0.0 mg/L 時(shí)，基本上沒有新芽分化的現(xiàn)象產(chǎn)生，說明6 －BA 在白桃試管苗的增殖培養(yǎng)中起到重要的作用。且當(dāng)6 －BA 為0 mg/L，IBA 從0 mg/L 開始上升時(shí)，有部分試管苗基部產(chǎn)生愈傷且伴有生根現(xiàn)象的產(chǎn)生(圖版I－D)，并隨著IBA 質(zhì)量濃度的增大生根試管苗數(shù)也會(huì)隨之增大，說明IBA 與白桃試管苗的生根有一定的關(guān)系。

為了進(jìn)一步研究不同激素對(duì)試管苗增殖的影響，對(duì)桃增殖系數(shù)進(jìn)行方差分析。從表2 中可以看出，6 －BA 對(duì)增殖系數(shù)的影響均達(dá)到了顯著水平，而IBA 對(duì)增殖系數(shù)的影響不顯著。因此，綜上所述，白桃最適合的增殖培養(yǎng)基是MS+6 －BA1.0 mg/L+IBA 0 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂6 g/L。

2.3 不同因素對(duì)白桃試管苗生根的影響

從表3 中可以看出，試管苗在Y3 培養(yǎng)基上生根率最高，為82.22%。且根系生長(zhǎng)狀況良好，粗且長(zhǎng)(圖版I－E)。在Y7 培養(yǎng)基上，桃試管苗的生根系數(shù)最高(圖版I－F)，為5.96，但根較為粗短。隨著IBA、NAA 質(zhì)量濃度的不斷提高，根基部會(huì)有愈傷產(chǎn)生。為了進(jìn)一步分析各因素對(duì)試管苗生根的影響，對(duì)生根率、生根系數(shù)進(jìn)行極差、方差分析，并對(duì)各處理間進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

表1 不同激素濃度對(duì)白桃增殖的影響Tab.1 Efiects of different concentrations of hormone on the mutiplication of the white peach

表2 不同因素對(duì)白桃增殖系數(shù)的方差分析Tab.2 The variance analysis of the effect of different factors on the mutiplication rate of the white peach

表3 不同因素對(duì)白桃試管苗生根的影響Tab.3 Efiects of different factors on the rooting of the white peach

從表4 中對(duì)各個(gè)因素進(jìn)行極差分析中可以看出，基本培養(yǎng)基對(duì)桃試管苗生根率的影響最大，NAA次之，IBA 最小。表5 為不同因素對(duì)生根率的方差分析，從表中可以看出，各個(gè)因素對(duì)試管苗生根率的影響均達(dá)到了極顯著的水平。F 值越大，該因素對(duì)試管苗生根率的影響也越大。從表5 中可以看出，對(duì)桃試管苗生根率影響的主次順序分別為基本培養(yǎng)基＞NAA ＞IBA，與極差分析的結(jié)果一致。表6 是對(duì)各處理進(jìn)行顯著性檢測(cè)，處理3 與其它處理間有極顯著的差異。綜上所述，1/4 MS +IBA 0 mg/L +NAA 0.4 mg/L 為誘導(dǎo)生根的最佳培養(yǎng)基。

從表7 極差分析中可以看出，基本培養(yǎng)基對(duì)試管苗生根系數(shù)的影響最大，其次是IBA，NAA 最小。從表8 中各個(gè)因素對(duì)試管苗生根系數(shù)影響的方差分析也中可以看出，IBA 和基本培養(yǎng)基對(duì)桃試管苗生根系數(shù)的影響達(dá)到了極顯著的水平，而NAA 對(duì)其影響未達(dá)到顯著水平。通過F 檢驗(yàn)可知對(duì)桃試管苗生根系數(shù)影響各因素的主次順序分別為基本培養(yǎng)基＞IBA ＞NAA。從表9 中可以看出，處理7 與其余各處理間的差異達(dá)到了顯著水平。綜上所述，1/2 MS +IBA 0.5 mg/L+NAA 0 mg/L，為誘導(dǎo)生根數(shù)的最佳培養(yǎng)基。

表4 不同因素對(duì)白桃試管苗生根率的極差分析Tab.4 The range analysts of the effects of different factors on the rooting rate of the white peach

表5 不同因素對(duì)白桃試管苗生根率的方差分析Tab.5 The variance analysis of the effects of different factors on the rooting rate of the white peach

表6 各處理間對(duì)白桃試管苗生根率的顯著性檢驗(yàn)Tab.6 Significance level test of the effects of different treatments on the rooting rate of the white peach

表7 不同因素對(duì)白桃試管苗生根系數(shù)的極差分析Tab.7 The range analysts of the effects of different factors on the rooting number of the white peach

表8 不同因素對(duì)白桃試管苗生根系數(shù)的方差分析Tab.8 The variance analysis of the effects of different factors on the rooting number of the white peach

表9 各處理間對(duì)白桃試管苗生根系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)Tab.9 Significance level test of the effects of different treatments on the rooting number of the white peach

3 討 論

3.1 細(xì)胞分裂素是誘導(dǎo)白桃的增殖的主要因素

Fouad MM 等研究表明，含高質(zhì)量濃度的6-BA 且不含 IBA 的培養(yǎng)基有利于腋芽分生組織生長(zhǎng)［21］。在本試驗(yàn)也表明，當(dāng)6-BA 質(zhì)量濃度為1.0 mg/L，IBA 為 0 mg/L 時(shí)，白桃試管苗的增殖效果最好。且 6-BA 對(duì)白桃增殖的影響達(dá)到了顯著的水平。當(dāng)6-BA為0 mg/L 時(shí)，基本沒有新芽的產(chǎn)生。本試驗(yàn)表明 MS + 6-BA1.0 mg/L+IBA 0 mg/L 為白桃最佳增殖培養(yǎng)基，但如果長(zhǎng)期的繼代容易發(fā)生玻璃化及畸形苗，而適當(dāng)減少6-BA 的質(zhì)量濃度可以在一定程度上減少玻璃化及畸形苗現(xiàn)象的產(chǎn)生。

圖版I 白桃成熟胚培養(yǎng)與植株再生Fig.I Mature embryo culture and plant regenerate of white peach

3.2 培養(yǎng)基中的離子濃度及生長(zhǎng)素濃度對(duì)白桃的生根有很大的影響

一般而言，試管苗生根均需要在低鹽培養(yǎng)基中進(jìn)行，這是由于鹽濃度變化導(dǎo)致培養(yǎng)基滲透壓變化，從而影響試管苗對(duì)營(yíng)養(yǎng)吸收和向培養(yǎng)基中釋放物質(zhì)。而且鹽濃度的變化也使植株體內(nèi)氮濃度下降到一個(gè)適合生根的有利水平［22］。生長(zhǎng)素也是影響生根的重要因子，但是誘導(dǎo)生根時(shí)生長(zhǎng)素的濃度不宜過高。本試驗(yàn)也表明，基本培養(yǎng)基及IBA 對(duì)桃生根率及生根系數(shù)的影響均達(dá)到了極顯著的水平。NAA 對(duì)桃生根率的影響也達(dá)到極顯著的水平，但對(duì)生根系數(shù)的影響不顯著。有研究表明添加IBA 后，無根苗生根整齊均勻，且隨著IBA 的質(zhì)量濃度增加，生根率和生根數(shù)呈增加趨勢(shì)［23］，但從本試驗(yàn)中看出，當(dāng)IBA 的質(zhì)量濃度適當(dāng)降低時(shí)，反而有利于生根率的提高但是不利于生根數(shù)的提高?？赡苁怯捎诓煌蛐鸵蛩氐挠绊?。本實(shí)驗(yàn)表明，1/4 MS +IBA 0 mg/L+NAA 0.4 mg/L 為誘導(dǎo)白桃生根的最佳培養(yǎng)基，1/2 MS +IBA 0.5 mg/L+NAA 0 mg/L 為誘導(dǎo)白桃生根數(shù)的最佳培養(yǎng)基。

3.3 玻璃化是阻礙白桃試管苗增殖的一大因素

在白桃試管苗增殖的過程中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)增殖到第3 代時(shí)，白桃試管苗玻璃化程度會(huì)迅速提高。且隨繼代次數(shù)的增加，白桃試管苗長(zhǎng)勢(shì)會(huì)不斷減弱且玻璃化程度也隨之增加。而玻璃化的試管苗分化能力低下，難以增殖成苗也難以生根成苗，因此降低桃試管苗增殖過程中的玻璃化率將是今后研究的重點(diǎn)。

［1］陳正華.木本植物組織培養(yǎng)及其應(yīng)用［M］.北京:高等教育出版社，2005:204-207.

［2］中國(guó)農(nóng)業(yè)百科全書編務(wù)委員會(huì).中國(guó)農(nóng)業(yè)百科全書:果樹卷［M］.北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1993:249.

［3］Smigoeki A C，Hammerschlag F A.Regeneration of plants from peach embryo cells infected with a shooty mutant strain of Agrobacterium［J］.J Am Soc，Hortic Sci，2001，116:1092-1097.

［4］吳延軍，張上隆，徐昌杰，等.根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的桃幼胚轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)參數(shù)研究［J］.果樹學(xué)報(bào)，2004，21(5):477-479.

［5］吳延軍，張上隆，謝鳴，等.桃 ACO 基因反義轉(zhuǎn)化桃幼胚子葉的研究［J］.遺傳，2006，28(1):65-70.

［6］中國(guó)科學(xué)院北京植物研究所五室形態(tài)組，北京市農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究所林業(yè)室果樹組.早熟桃的培育［J］.植物學(xué)雜志，1974，1(4):23-25.

［7］姚強(qiáng)，王德春，吳鈺良.桃、油桃和蟠桃幼胚愈傷組織誘導(dǎo)和植株再生［J］.上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，1990，6(3):23-29.

［8］Chen Zhiling，Zhang Chenghe，Lu Zhengren，et al.Excised root culture of peach and apricot［J］.Advances in Horticulture，2002(2):150-153.

［9］莊恩及，姚強(qiáng)，吳鈺良，等.早熟和特早熟桃胚珠培養(yǎng)研究［J］.園藝學(xué)報(bào)，1991，18(4):303-308.

［10］Hammerschlag F A，Bauchan G，Scorza R.Regeneration of peach plants from callus derived from immature embryos［J］.Theoretical and Applied Genetics，1985(70):248-251.

［11］劉用生，路廣明，胡霓云.離體培養(yǎng)條件下打破桃幼胚休眠初探［J］.河南職業(yè)技術(shù)師范學(xué)院學(xué)報(bào)，1993，21(3):68-69.

［12］孟新法，周維燕.桃胚乳離體培養(yǎng)再生植株的研究［J］.北京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1981，7(4):95-98.

［13］劉用生.胚珠培養(yǎng)技術(shù)在園藝植物上的應(yīng)用［J］.河南職技師院學(xué)報(bào)，1990，18(2):32-42.

［14］王玉柱，孫浩元，楊麗.核果類果樹胚培養(yǎng)研究進(jìn)展和育種成效［J］.果樹學(xué)報(bào)，2004，24(4):59-63.

［15］閻國(guó)華，周宇.桃幼胚下胚軸高頻植株離體再生［J］.果樹學(xué)報(bào)，2002，19(4):231-234.

［16］Scorza R M，Cordts S M.Long-term somatic embryoproduction and regeneration from embo-drived peach callus［J］.Acta-Horticulturae，1990，280:183-284.

［17］陳宗禮，馮曉東，云濤，等.晚蜜桃離體培養(yǎng)初探［J］.延安大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，21(4):61-64.

［18］尚敏克，姜國(guó)斌，尹偉倫，等.晚熟桃的離體組織培養(yǎng)［J］.遼寧林業(yè)科技，2002，3:5-7.

［19］田增勝，韓明玉，張滿讓，等.影響早熟油桃莖尖培養(yǎng)增殖效率的因素［J］.果樹學(xué)報(bào)，2005，22(3):279-282.

［20］趙勝利.桃梨離體再生體系建立及試管苗種質(zhì)保存研究［D］.福州:福建農(nóng)林大學(xué)，2008.

［21］Fouad M M，Gomaa A H，Zaher H A，et al.Factors influencing rooting of peach shoots cultured in vitro［J］.Acta Horticulturae，2005(409):197-202.

［22］Predieri S，Brizzi G，Gatti E.Effect of nitrogen supply on rooting of peach (Pyrus communis L.)microcuttings［J］.Advances in Horticultural Science，2009，13(2):68-70.

［23］石曉東，高潤(rùn)梅，劉漢云.川中白島桃離體培養(yǎng)［J］.經(jīng)濟(jì)林研究，2007，25(4):53-55.