張立穎，趙 萌，王躍智

(北京市水產(chǎn)科學研究所，北京 100068)

廣泛存在于細胞和組織中的超氧化物岐化酶(superoxide dismutase，SOD)是清除體內超氧陰離子自由基一種重要的酶，它由美國學者McCord 和Fridovich 于20 世紀60 年代末發(fā)現(xiàn)［1］。大量的基礎和臨床研究證實，當受到病毒、細菌入侵時，機體的免疫細胞會產(chǎn)生自由基物質(主要是氧自由基和一氧化氮自由基等)來殺滅細菌病毒，這是免疫反應中重要的一環(huán)，但是，當免疫反應過度，自由基產(chǎn)生過量時，它們的非特異反應特性會不加分辨地對受感染機體的生命基本結構分子如蛋白質、核苷酸、脂肪等產(chǎn)生極強的氧化硝化反應，導致對細胞、組織的攻擊。

SOD 作為生物體內超氧陰離子自由基的清潔劑，在防輻射、抗衰老、消炎、抑制腫瘤和癌癥、自身免疫治療等方面顯示出獨特的功能，在醫(yī)學、食品、化妝品等領域得到越來越多的應用。目前，世界各地學者對SOD 的研究方興未艾，深入研究SOD 不僅有著重大的理論意義，也有著重大的實際應用價值。不同動物，其SOD 的含量不同，即使同一種動物，其不同組織的SOD 含量也各不相同。通常以肝臟中的SOD 的含量最為豐富。陸生動植物SOD 的研究報道較多，水生生物方面僅有十幾個品種的SOD 被研究［2－12］，本文概述了水生生物(如魚、蝦、貝、藻)SOD 的種類分布及研究進展，并對其應用前景進行展望。

1 SOD 的種類及分布

SOD 按其結合的金屬離子不同，主要分為Cu/Zn－SOD、Fe－SOD 和Mn－SOD。Cu/Zn－SOD 主要存在于真核細胞的胞液和葉綠體中，呈現(xiàn)藍綠色，相對分子量約為32 000。它由2 個亞基組成，每個亞基各有1 個Cu2+和1 個Zn2+。Fe－SOD 和Mn－SOD 很相似［13］，但是它們有明顯的差異氨基酸以及對H2O2的敏感性［14－15］。Fe － SOD 多見于原核細胞及少數(shù)植物細胞中，為黃褐色，相對分子量約為38 700。它是由2 個亞基組成的，每個亞基中各含1 個Fe3+。紫紅色的Mn－SOD 在原核生物細胞及線粒體中也比較常見，相對分子量約為40 000。原核細胞中的Mn －SOD 是由2 個亞基組成，而來自真核細胞線粒體中的Mn－SOD，是由4 個亞基組成，且每個亞基各含有1 個Mn2+。20 世紀90 年代，人們又陸續(xù)從鏈霉菌屬中發(fā)現(xiàn)Ni－SOD 和Fe/Zn－SOD，在牛肝中發(fā)現(xiàn)了一種Co/Zn －SOD 等不同的SOD，這些都是少見的SOD。

2 SOD 的結構特征

2.1 Cu/Zn-SOD 的結構特征

不同來源的Cu/Zn－SOD 的氨基酸序列，無論是來自細菌、真菌高等植物細胞質或葉綠體，還是來自高等動物和人的細胞質，它們的同源性都較高，有些氨基酸很保守。在Cu/Zn －SOD 的氨基酸組成中，酪氨酸和色氨酸的含量甚微，甚至沒有。而甘氨酸含量較高，每6 ～8 個氨基酸殘基中就有1 個甘氨酸殘基。1975 年Richardson 得到了Cu/Zn－SOD 的三維結構［16］，發(fā)現(xiàn)它是由2 個基本相似的亞基組成的二聚體，且每個亞基含有1 個銅原子和1 個鋅原子。2 個相同亞基之間通過非共價鍵的疏水相互作用而締合，類似于圓筒的端面。Cu 與4 個來自組氨酸殘基(His44，46，61，118)的咪唑氮配位呈現(xiàn)1 個三角雙錐畸變的四方錐構型，Zn 則與3 個來自組氨酸殘基(His61，69，78)的咪唑氮和1 個天門冬氨酸殘基(Asp81)的羧基氧配位，呈畸變的四面體構型。

2.2 Fe-SOD 的結構特征

不同生物來源的Fe－SOD 一級結構同源性較低。Phalgun 等［17］比較了7 種嗜鹽古細菌家族的Fe－SOD，在199 個氨基酸中有125 個氨基酸完全一致(62%)，而它們與真菌和真核線粒體Fe －SOD 相比只有35% ～40%的同源性。但Donatella 等［18］研究了真核細胞Tetrahymena pyriformis 的四聚體Fe －SOD 并測序，氨基酸序列分析表明，與其它來源的Fe －SOD 相比，具有較低的同源性(33% ～34%)。Barry 等［19］認為對Fe－SOD 結構最有意義的特征之一是高度保守的芳香族氨基酸含量，特別是在活性部位的氨基酸殘基。占17%的蛋白序列的33 個保守氨基酸殘基分別是His、Tyr、Phe 和Trp，活性部位Fe 的 8A 范圍內發(fā)現(xiàn) 5 個保守氨基酸殘基，分別為 Tyr34、Tyr77、His30、Trp123 和 Trp158，其中，Trp 和Tyr34 存在于所有接近金屬開放結合位置。另外，在所有的Fe －SOD 中都存在嚴格保守的Gln70 和Tyr34 之間的相互作用，這對殘基之間的相互作用在酶的化學性質、結構及催化動力學方面都起著重要的作用，并與酶的金屬特異性相關。

到目前為止，發(fā)現(xiàn)Fe－SOD 具有二聚體和四聚體2 種形式。每一種形式都由各自相同的亞基組成。高嗜溫性菌株S.solfataricus 的Fe－SOD 晶體結構顯示，在每一對稱亞基中含2 個相同單體，形成一個緊湊的四聚體，與來源于結構分支桿菌的嗜溫性SOD 相比，在亞基之間的Fe 離子對的數(shù)量增多。電子數(shù)據(jù)顯示在活性部位保留氨基酸Tyr 殘基上存在特別的共價修飾。這可能與酶特殊高嗜溫性相關［20］。

2.3 Mn-SOD 的結構特征

任何生物來源的Mn－SOD 的一級結構的同源性都很高。如人Mn －SOD 和鼠、大腸桿菌的Mn －SOD 的同源性分別為94%和43%，不僅如此，參與形成活性中心及與金屬連接的氨基酸在所有Mn －SOD 中都是保守的，而且與金屬錳相連的氨基酸在所有Mn －SOD 中也是保守的，它們是His26、His87、His181 和Asp185。Mn－SOD 的CD 譜表明，其含有較高程度(大于32%)的α 螺旋結構，較少β 折疊。由一級結構預測的二級結構表明，Mn－SOD 中不可能存在象Cu/Zn －SOD 那種八股反平行的β 折疊，也不存在長的松散環(huán)，整個結構比較緊湊。電子自旋共振(ESR)和核磁共振(NMR)研究揭示Mn－SOD中的金屬離子是處于高度自旋狀態(tài)的3 價錳Mn3+。Mn－SOD 的金屬輔基上結合有1 個水分子。金屬輔基對蛋白質結構有穩(wěn)定作用，而且與Mn－SOD 的活性直接相關。

Mn－SOD 的活性中心都是具有五配位的三角雙錐結構，其中一個軸向配體為水分子，來自蛋白質輔基的4 個配位基為His28、His83、Aspl66 和His170。后3 個配位基位于赤道平面，His28 的咪唑基則占據(jù)著另一個軸向位置。活性部位處在一個主要由疏水殘基構成的疏水殼子里，兩個亞基鏈共同開成一個通道，該通道終止于金屬離子附近的Try36 和His32 殘基，是底物或其他內界配體接近Mn2+離子的經(jīng)由之路。His33、Trp37、His83 和Tyr36 形成一個疏水口袋，該口袋構成底物結合部位。

3 SOD 的理化性質

SOD 是一種酸性蛋白，在酶分子上共價連結金屬輔基，因此它對熱、pH 以及某些理化性質表現(xiàn)出異常的穩(wěn)定性。

3.1 溫度對SOD 的影響

溫度是生物生存環(huán)境的重要因素之一。因為細胞膜的成分中含有脂類，所以溫度過高或過低都會對細胞膜系統(tǒng)造成影響，進一步破壞細胞內的蛋白質和DNA 等。SOD作為一種細胞膜保護酶在溫度脅迫下發(fā)揮作用。SOD 酶活性在適宜溫度范圍外隨溫度和時間的變化而下降，僅在適宜溫度范圍內趨于穩(wěn)定，表1 是不同來源SOD 酶的熔點溫度(范圍)。

3.2 pH 對 SOD 的影響

SOD 在 pH5.3 ～ 10.5 內其催化速度不受影響。如 pH3.6，SOD中 Zn 要脫落 95% ，pH12.2，SOD 的構象會發(fā)生不可逆的轉變，從而導致酶活性喪失。SOD 對pH 的穩(wěn)定性同樣歸因于金屬輔基的存在，一旦去除金屬離子，其穩(wěn)定性就大大下降。實驗表明，不同來源的SOD，其等電點pI 值也不相同，見表2。

3.3 SOD 的紫外吸收

SOD 具有特殊的光吸收，F(xiàn)e－SOD 不含Cys，而含有較多的Trp 和Tyr，不同來源的Fe－SOD 的吸收峰為 278 ～280 nm［21－22］。且 Cu/Zn － SOD 的紫外吸收峰在 260 nm 附近［23］，Mn － SOD 的吸收峰為 280～282 nm，不同來源SOD 的紫外吸收值見表3。

3.4 酶活性

SOD 是金屬酶，在Cu/Zn－SOD 酶中，Cu 與Zn 的作用是不同的，Zn 僅與酶分子結構有關，而與催化活性無關，而Cu 與催化活性有關，透析去除Cu 則酶活性全部喪失，一旦重新加入，其活性又可恢復。同樣，在 Mn － SOD、Fe － SOD 和 Ni － SOD 中，Mn、Fe 和 Ni 與 Cu 一樣，對酶活性是必需的。不同來源SOD 的紫外吸收值見表4。

3.5 分子量

Cu/Zn－SOD 是一個二聚體，均含有2 個相同的亞基，每個亞基有一個Cu2+和Zn2+，全酶分子量一般為31 ～33 ku，亞基分子量為15 ～17 ku。Mn－SOD 的相對分子量隨來源不同而異，來自原核生物的Mn－SOD 相對分子量約為40 ku，由2 個亞基組成，每個亞基各含有l(wèi) 個Mn2+，其分子量為19 ～21 ku，來白真核生物線粒體的Mn －SOD，相對分子量為80 ku，由4 個亞基組成，每個亞基分子量為19.5 ～21 ku。Fe－SOD 廣泛存在于原核生物中，按其結構可分為兩類，一類是分子量約為40 ～50 ku 的二聚體，亞基分子量約為20 ～26 ku;另一類是分子量約為80 ～90 ku 的四聚體，其亞基分子量約為23 ku。不同來源SOD 酶及其亞基的分子量見表5。

表1 不同來源SOD 的熔點溫度(溫度范圍)Tab.1 The denaturing temperature of SOD from different sources

表2 不同來源SOD 的等電點Tab.2 The pI of SOD from different sources

表3 不同來源SOD 的最大紫外吸收值Tab.3 The maximum ultraviolet absorption value of SOD from different sources

表4 不同來源SOD 酶比活力Tab.4 The enzyme specific activity of SOD from different sources

3.6 金屬離子對SOD 活性的影響

不同濃度的金屬離子對SOD的活性有著不同的影響，在低濃度下，它可以提高SOD 的活性，而在高濃度下，SOD 的活性將顯著下降。張爾賢等發(fā)現(xiàn) 0.02 mol/LKCN 30 μL即可使鯊魚肝臟SOD 酶活性被抑制50%。王偉偉發(fā)現(xiàn) Ca2+、Cu2+、Zn2+、Mn2+4 種金屬離子對 3 種蝦肌肉組織中SOD 活性則是低濃度起促進作用，高濃度具有明顯的抑制作用，但抑制程度不同。此外，郜趙偉等［24］發(fā)現(xiàn)，Zn2+、Cd2+對南方鯰(Silurus meridionalis)肝超氧化物歧化酶活性有強烈的抑制作用;而張迎梅等［25］研究重金屬脅迫對泥鰍肝胰臟超氧化物歧化酶活性的影響，得出Zn2+對超氧化物歧化酶有一定的激活作用。

4 SOD 基因的克隆表達

隨著生物技術的快速發(fā)展，很多種類的SOD 基因的克隆和分離已經(jīng)獲得成功，并且具有生物活性。郭建軍等［26］根據(jù)SOD 的蛋白質保守序列，以念珠藻Fe －SOD 基因序列為基礎設計引物，通過PCR 擴增得到鈍頂螺旋藻的Fe － SOD 基因。通過測序發(fā)現(xiàn)此基因長528 bp，含有1 個ORF(open reading frame)，編碼170 個氨基酸殘基。IPTG 誘導表達表明，F(xiàn)e －SOD 融合蛋白實現(xiàn)了高水平表達，在最佳表達條件37 ℃、1 mmol/L IPTG 濃度、誘導表達5 h 后，其外源基因表達量占全菌蛋白的78%，刷新了原核表達SOD 高產(chǎn)的新記錄。這是我國首次利用基因工程方法獲得Fe －SOD。這也為進行螺旋藻SOD的基因的克隆和表達奠定了堅實的基礎。

目前，包括魚類在內的大型水生生物的內臟通常都被丟棄，沒有充分利用。從目前的研究中可以看到水生生物具有很高的SOD 活性，SOD 具有抗衰老、抗炎、抗疾病、抗輻射等多種作用。用魚類在內的大型水生生物的內臟為原料，開發(fā)一種新的SOD 制劑，既可變廢為寶，又可減輕環(huán)境污染，將很有發(fā)展前景。

表5 不同來源SOD 酶及其亞基的分子量Tab.5 The molecular weights of SOD and their subunits from different sources

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