王文祥，劉亭亭，吳小波 ，張 飛

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 蜜蜂研究所，江西 南昌 330045)

意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica.)簡(jiǎn)稱意蜂，在分類學(xué)上屬膜翅目(Hymenoptera)蜜蜂科(Apidae)蜜蜂屬(Apis)，是世界上優(yōu)勢(shì)最大的一個(gè)蜂種，于20 世紀(jì)初引入我國(guó)。因其能夠促進(jìn)農(nóng)作物授粉，具有較強(qiáng)的產(chǎn)蜜、產(chǎn)漿能力，已在我國(guó)大部分地區(qū)進(jìn)行飼養(yǎng)，并成為本地的當(dāng)家品種［1］。

蜜蜂在自然條件下，通?？梢詮耐饨绔@取營(yíng)養(yǎng)食物，其中植物中的花蜜和花粉是蜜蜂的主要食物。然而，在受蜜源缺乏、惡劣氣候等因素的影響時(shí)，蜂群采不到足夠的花蜜和花粉，就需要人工補(bǔ)喂糖飼料和蛋白飼料，以保證蜜蜂正常生活。劉俊峰等人研究了蜜蜂早春外界缺少花粉和花蜜時(shí)蛋白飼料的需要［2－3］。目前對(duì)蜜蜂的糖飼料飼喂主要以白砂糖為主，對(duì)糖飼料的代替品研究較少。近年來(lái)，隨著白砂糖價(jià)格的一路上揚(yáng)，不少蜂農(nóng)開(kāi)始用果葡糖漿代替白砂糖飼喂蜂群。

果葡糖漿，也稱高果糖漿(high fructose syrup)或異構(gòu)糖漿，是以酶法轉(zhuǎn)化淀粉所得的糖化液經(jīng)葡萄糖異構(gòu)酶的異構(gòu)作用，將其中一部分葡萄糖異構(gòu)成果糖，由葡萄糖和果糖組成的一種混合糖糖漿［4］?，F(xiàn)在市場(chǎng)上主要是F42 和F55 兩個(gè)品種，因其甜度與白砂糖相近，所以被蜂農(nóng)用來(lái)飼喂蜂群。目前，對(duì)果葡糖漿作為蜜蜂糖飼料的安全問(wèn)題還存在著不少爭(zhēng)議。據(jù)沈育初等［5］報(bào)道，認(rèn)為果葡糖漿可以替代白砂糖飼喂蜂群;而陳淵等［6］認(rèn)為用果葡糖漿作蜜蜂越冬飼料得不償失。正是鑒于此。本實(shí)驗(yàn)擬研究飼喂果葡糖漿對(duì)蜂群育王及工蜂抗氧化酶基因的表達(dá)量的影響，探討果葡糖漿作為蜜蜂糖飼料的可行性，為蜜蜂飼料研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 供試?yán)ハx(chóng) 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)蜜蜂研究所飼養(yǎng)的意大利蜜蜂。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)時(shí)間和地點(diǎn) 2011 年3 月—2011 年11 月，江西農(nóng)業(yè)大學(xué)蜜蜂研究所。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)用糖 白砂糖(廣西華盛集團(tuán)露塘糖業(yè)有限責(zé)任公司糖廠，一級(jí));果葡糖漿(江西天禾糖業(yè)發(fā)展有限公司，F(xiàn)42)。

1.1.4 試劑及儀器 總RNA 提取試劑盒Trizol，RNA 酶抑制劑購(gòu)自全式金公司;瓊脂糖購(gòu)自Promega公司;DNA marker DL2000，M－MLV 反轉(zhuǎn)錄酶及SYBR GreenⅡ熒光定量試劑購(gòu)自TaKaRa 公司。離心機(jī)(飛鴿KA－1000 型，上海安亭科學(xué)儀器廠)，臺(tái)式冷凍離心機(jī)(Eppendorf 5810R)，移液器(Eppendorf)，PCR 儀(eppendorf mastercycler personal)，Real－Time PCR System (Bio－Rad 公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蜂群飼養(yǎng)管理 選用群勢(shì)一致的健康意大利蜜蜂10 群，隨機(jī)分為2 組，每組5 群。其中處理組飼喂果葡糖漿(treatment)，對(duì)照組飼喂白砂糖(control)。試驗(yàn)期間，外界缺少蜜源，定期檢查蜂群并進(jìn)行飼喂，以保證蜂群內(nèi)有充足的食物，其它飼養(yǎng)條件(如自由采水、防病等)也調(diào)整一致。飼喂果葡糖漿兩個(gè)月后，進(jìn)行育王和工蜂樣品采集。

1.2.2 飼喂果葡糖漿對(duì)蜂群育王質(zhì)量的影響 另選一群健康的蜂群作為供蟲(chóng)源，移取剛孵化的1 日齡工蜂幼蟲(chóng)到王臺(tái)，并分別插入到兩組實(shí)驗(yàn)蜂群中，3 d 后取漿。統(tǒng)計(jì)移蟲(chóng)臺(tái)數(shù)和接受臺(tái)數(shù)，接受臺(tái)數(shù)除以移蟲(chóng)臺(tái)數(shù)為王臺(tái)接受率;用分析天平稱量王漿重量，記錄單個(gè)王臺(tái)的產(chǎn)漿量。

另外，從供蟲(chóng)源中移取剛孵化的幼蟲(chóng)到育王框中，分別放入到兩組實(shí)驗(yàn)蜂群中進(jìn)行育王，等到蜂王出房前1 d，將產(chǎn)漿條放入恒溫恒濕箱中進(jìn)行培養(yǎng)(35 ℃，RH 75%)，待蜂王出房后，每組選取30 只，用分析天平測(cè)量處女蜂王體質(zhì)量。

1.2.3 飼喂果葡糖漿對(duì)意大利蜜蜂工蜂Cu－Zn SOD、CAT 基因mRNA 表達(dá)量的影響 (1)蜜蜂樣品采集。分別從兩組實(shí)驗(yàn)群中選取即將出房的封蓋子脾，放入恒溫培養(yǎng)箱(35 ℃，RH 75%)，待工蜂出房后，在其胸部背側(cè)進(jìn)行顏色標(biāo)記，并放回原群。分別采集1 日齡、10 日齡及30 日齡蜜蜂樣品。每群蜂取30 只蜜蜂，隨機(jī)取4 只蜜蜂的頭部，混合，作為1 個(gè)樣品用于抗氧化酶基因mRNA 表達(dá)量的檢測(cè)，每個(gè)樣品3 個(gè)重復(fù)。取樣后蜜蜂樣品立即放入液氮速凍，隨后放入－80 ℃保存，用于提取總RNA。

(2)RNA 的提取和cDNA 第一鏈的合成。用Trizol 試劑盒進(jìn)行工蜂樣品的RNA 提取。所有操作均按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，RNA 最后溶于30 μL RNA－free 的dH2O 中，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)后，－80 ℃保存。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)總RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系為50 μL:8 μL 總RNA，10 μL Buffer，8 μL dNTP，1.5 μL M － MLV，3 μL Oligo dT，1 μL RNA 酶 Inhibitor，18.5 μL DEPC 水。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件如下:體系混勻后，42 ℃反應(yīng)60 min，75 ℃滅活5 min。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物保存于－80 ℃。

(3)實(shí)時(shí)熒光定量PCR。所有引物均按照SYBR premix Ex TaqTM 試劑盒要求，參照GenBank 上已發(fā)表的序列，采用 DNAMAN 5.0 設(shè)計(jì)引物(跨內(nèi)含子)，引物序列見(jiàn)表1。qRT － PCR 反應(yīng)體系為20 μL:4 μL 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，目的基因上游和下游引物各 0.4 μL，5.2 μL H2O，10 μL SYBR GreenⅡ;PCR擴(kuò)增程序:94 ℃預(yù)變性 3 min，94 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，40 個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min;最后以每5 s 上升0.5 ℃的速度從61 ℃到95 ℃記錄熔解曲線，每個(gè)反轉(zhuǎn)錄樣品重復(fù)3 次。使用儀器為 Bio －Rad 公司 iCycler iQ。反應(yīng)結(jié)束后收集目的基因與內(nèi)參基因的Ct 值，每個(gè)PCR 反應(yīng)的擴(kuò)增效率用qpcR，R 來(lái)計(jì)算［7］。

基因的相對(duì)表達(dá)量用以下公式計(jì)算:

(1)式中E 是PCR 擴(kuò)增效率;Ct 是循環(huán)閾值;i 是第i 個(gè)內(nèi)參基因;n 是內(nèi)參基因數(shù)量;r 是目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 Cu-Zn SOD，CAT 和β-actin 基因擴(kuò)增產(chǎn)物Tab.1 Oligo-nucleotide primer pairs used in the amplification of Cu-ZnSOD，CAT and β-actin genes

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用StatView 5.0 的ANOVA and t －test 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各處理平均數(shù)間用ANOVA 或ANCOVA 進(jìn)行差異顯著性比較及相關(guān)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼喂果葡糖漿對(duì)意大利蜜蜂王臺(tái)接受率及王臺(tái)中王漿量的影響

表2 飼喂果葡糖漿對(duì)對(duì)意大利蜜蜂產(chǎn)漿量及王臺(tái)接受率的影響Tab.2 The effect of high fructose syrup diet on production of royal jelly and the acceptance rate of queen cells of Apis mellifera L.

如表2 所示，從單個(gè)王臺(tái)產(chǎn)漿量來(lái)看，飼喂果葡糖漿的處理組和飼喂白砂糖的對(duì)照組差異不顯著。在王臺(tái)接受率方面，處理組和對(duì)照組之間差異也不顯著。

2.2 飼喂果葡糖漿對(duì)意大利蜜蜂處女蜂王初生體質(zhì)量的影響

由圖1 可知，在其它外界條件相同的情況下，飼喂果葡糖漿的意大利蜜蜂蜂群所培育的蜂王與對(duì)照組蜂群所培育的蜂王在初生體質(zhì)量方面差異不顯著。

圖1 飼喂果葡糖漿對(duì)意大利蜜蜂蜂王初生體質(zhì)量的影響Fig.1 The effect of high fructose syrup diet on emergence weight of queen of Apis mellifera L.

2.3 飼喂果葡糖漿對(duì)意大利蜜蜂Cu-Zn SOD、CAT 基因 mRNA 表達(dá)量影響

從圖2 和圖3 可知，Cu-Zn SOD 和CAT 這兩個(gè)抗氧化酶基因在意大利蜜蜂3個(gè)不同日齡工蜂頭部中均有表達(dá)，而且各個(gè)時(shí)期Cu-Zn SOD mRNA 的表達(dá)量均高于內(nèi)參基因(r ＞0)，而CAT mRNA 的表達(dá)量均低于內(nèi)參基因(r ＜0)。但是，在工蜂的3 個(gè)日齡中，處理組蜜蜂頭部Cu-Zn SOD、CAT 基因mRNA 的表達(dá)量和對(duì)照組之間差異不顯著。

圖2 意大利蜜蜂不同發(fā)育時(shí)期CuZnSOD mRNA 表達(dá)量Fig.2 Cu-Zn SOD mRNA expression level in Apis mellifera L.at different development stages

圖3 意大利蜜蜂不同發(fā)育時(shí)期CAT mRNA 表達(dá)量Fig.3 CAT mRNA expression level in Apis mellifera L.at different development stages

3 討 論

3.1 飼喂果葡糖漿對(duì)意大利蜜蜂王臺(tái)漿量及王臺(tái)接受率的影響

蜂群產(chǎn)漿量和王臺(tái)接受率與蜂王的品種、蜂群的管理、外界氣候、蜜粉源、蜂群群勢(shì)和飼養(yǎng)營(yíng)養(yǎng)水平等因素有關(guān)。方文富等研究發(fā)現(xiàn)蜂王漿的產(chǎn)量與蜂王的品種、移入王臺(tái)內(nèi)幼蟲(chóng)的大小等有一定的關(guān)系［8－9］。Mouro［10］、Sahinler 等［11］報(bào)道蜂群產(chǎn)漿量和王臺(tái)接受率與季節(jié)和蜜蜂基因型相關(guān)。王改英［12］、羅建能等［13］研究表明飼糧蛋白水平與蜂群王漿產(chǎn)量和王臺(tái)接受率密切相關(guān)。本研究在其它條件相同的情況下，分別飼喂果葡糖漿和白砂糖，檢測(cè)其對(duì)王臺(tái)漿量和王臺(tái)接受率的影響。結(jié)果表明:使用果葡糖漿代替白砂糖飼喂蜂群對(duì)單個(gè)王臺(tái)產(chǎn)漿量和王臺(tái)接受率無(wú)顯著差異。這可能是因?yàn)楣咸菨{作為糖飼料，其能量效價(jià)與白砂糖相近，在蜜蜂體內(nèi)除了提供蜜蜂發(fā)育和維持日常采集活動(dòng)所需的能量外，并不對(duì)器官(例如:咽下腺)的形成和發(fā)育造成不良影響。

3.2 飼喂果葡糖漿對(duì)意大利蜜蜂蜂王初生質(zhì)量的影響

蜂王初生體質(zhì)量與卵巢管的發(fā)育程度和卵小管的數(shù)目成正相關(guān)，初生體質(zhì)量大的蜂王，具有較強(qiáng)的產(chǎn)卵能力［14］。因此，蜂王的初生體質(zhì)量是衡量蜂王品質(zhì)優(yōu)劣的重要標(biāo)志。據(jù)報(bào)道，蜂王的初生體質(zhì)量與季節(jié)、蜜源、降水量、群勢(shì)等有著密切的相關(guān)性［15］。在其它條件都相同的情況下，蜂王初生體質(zhì)量與哺育蜂分泌的蜂王漿的質(zhì)量密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn):飼喂果葡糖漿的蜂群和飼喂白砂糖蜂群所培育的蜂王的初生體質(zhì)量差異不顯著。這可能是因?yàn)轱曃构咸菨{與飼喂白砂糖對(duì)哺育蜂所分泌的王漿組分影響不大所致，是否如此，有待進(jìn)一步研究與論證。

3.3 飼喂果葡糖漿對(duì)意大利蜜蜂Cu-Zn SOD、CAT 基因mRNA 表達(dá)量影響

在有氧條件下，動(dòng)物機(jī)體的正常代謝過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的氧自由基，過(guò)多的自由基如果不能及時(shí)被清除，將會(huì)攻擊各種生物大分子，引起一系列氧化損傷，進(jìn)而導(dǎo)致生物體衰老和病變。正常情況下，細(xì)胞內(nèi)的自由基處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，不會(huì)引起傷害，這是因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)存在著自由基清除系統(tǒng)，該系統(tǒng)主要是通過(guò)有關(guān)的抗氧化酶清除機(jī)體內(nèi)的自由基［16］。本研究結(jié)果表明，三個(gè)不同發(fā)育時(shí)期，Cu－Zn SOD、CAT基因在蜜蜂頭部均有表達(dá)，其中Cu－Zn SOD 基因在三個(gè)時(shí)期的mRNA 表達(dá)量均高于內(nèi)參基因(r ＞0)，而CAT mRNA 的表達(dá)量均低于內(nèi)參基因(r ＜0)。與飼喂白砂糖相比，飼喂果葡糖漿對(duì)同日齡工蜂抗氧化酶基因Cu－Zn SOD、CAT mRNA 的表達(dá)量無(wú)顯著影響。這可能是因?yàn)楣咸菨{與白砂糖(蔗糖)水解后的成分相近，在蜜蜂機(jī)體內(nèi)有著和白砂糖相似的代謝途徑，蜜蜂食用果葡糖漿后，可能不會(huì)對(duì)其形成應(yīng)激。另外，隨著日齡的增加，兩組實(shí)驗(yàn)組的工蜂Cu －Zn SOD 基因mRNA 的表達(dá)量也隨之增加，其表達(dá)量在30 日齡時(shí)，達(dá)到最大值。這可能與工蜂的勞動(dòng)強(qiáng)度與所處環(huán)境有關(guān)。蜂群內(nèi)工蜂按日齡分工，隨著日齡的增長(zhǎng)，工蜂的勞動(dòng)強(qiáng)度也不斷加大。而且，工蜂由內(nèi)勤蜂轉(zhuǎn)變?yōu)椴杉洌齻兯幍沫h(huán)境由原來(lái)相對(duì)穩(wěn)定的蜂箱內(nèi)環(huán)境轉(zhuǎn)換成充滿不定因素的外界自然環(huán)境，從而使Cu －Zn SOD 基因表達(dá)量增加。另外，CAT 基因mRNA 的表達(dá)量，則出現(xiàn)先增加，后降低的趨勢(shì)，其表達(dá)量在10 日齡時(shí)，達(dá)到最大值。這可能是因?yàn)?0 日齡工蜂分泌蜂王漿，飼喂小幼蟲(chóng)和蜂王，導(dǎo)致其頭部代謝比較旺盛，CAT 的活性較高。本研究結(jié)果與肖培新等［17］的報(bào)道不同，可能與所采蜜蜂樣品發(fā)育時(shí)期和提取RNA 的器官和組織不同有關(guān)［18］，這也有待于進(jìn)一步研究與分析。

致謝:在本實(shí)驗(yàn)得到了黃強(qiáng)、曾珍秀、韓旭和田柳青的幫助，在此表示感謝。

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