許陽光，張金玲，劉 亮，李學(xué)鋒*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 理學(xué)院，北京 100094;2.農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所，北京 100024)

喹禾靈(quizalofop－p－ethyl)化學(xué)名稱2 －［4 －(6 －氯－2 －喹惡啉氧基)苯氧基］丙酸乙酯，是20世紀(jì)80 年代開發(fā)的一種芳氧苯氧丙酸類除草劑，為選擇性內(nèi)吸傳導(dǎo)型除草劑，喹禾靈在植物組織和土壤微生物的作用下快速水解成相應(yīng)的酸，可以有效抑制目標(biāo)雜草葉綠體內(nèi)的乙酰輔酶A 羧化酶，是一種較理想的莖葉處理劑。喹禾靈含有一個(gè)手性碳原子，有一對(duì)光學(xué)異構(gòu)體，其中只有R 體有除草活性，S 體是不具有除草活性。大多數(shù)情況，喹禾靈都以R 體的形式(精喹禾靈)生產(chǎn)并應(yīng)用，精喹禾靈含量及R－對(duì)映體與S－對(duì)映體的比值，是衡量其原藥及制劑產(chǎn)品質(zhì)量的最主要指標(biāo)。

長(zhǎng)期以來，人類在研究手性農(nóng)藥的環(huán)境行為及生態(tài)效應(yīng)時(shí)，常常將含有兩種或兩種以上對(duì)映體的外消旋體農(nóng)藥當(dāng)作一種農(nóng)藥來處理，這樣往往不能真實(shí)地反映其對(duì)環(huán)境可能造成的危害和對(duì)人類健康的潛在影響。這就迫使我們必須進(jìn)行手性農(nóng)藥對(duì)映體的選擇性環(huán)境安全評(píng)價(jià)研究，重新考慮其對(duì)環(huán)境和人類健康所可能造成的影響，為環(huán)境治理和研發(fā)高效、低毒、低殘留的新型農(nóng)藥提供依據(jù)。此外，對(duì)映體空間結(jié)構(gòu)上的細(xì)微差別即可引起毒性效應(yīng)的顯著不同，這就為化合物毒理機(jī)制的研究提供了參考。因此，在對(duì)映體水平上研究手性農(nóng)藥的環(huán)境行為和生態(tài)效應(yīng)，具有十分重要的理論價(jià)值和實(shí)際意義。

有研究發(fā)現(xiàn)部分手性農(nóng)藥對(duì)水生生物的急性毒性存在顯著的對(duì)映體選擇性［1，2］。如聯(lián)苯菊酯、氯菊酯、氯氰菊酯、氟蟲腈、丙草胺及甲霜靈等手性農(nóng)藥［3］。在大型溞和網(wǎng)紋水溞的急性毒性與擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的對(duì)映體選擇性相關(guān)研究中，針對(duì)cis－BF 而言，只有1R－cis－BF 表現(xiàn)出對(duì)網(wǎng)紋水溞的急性毒性;在氰戊菊酯對(duì)大型溞的急性毒性試驗(yàn)中，αS －2S － FV 的急性毒性顯著高于 αR －2R － FV［4］;在氯菊酯中，1R－順式體和1R－反式體表現(xiàn)出相對(duì)顯著的農(nóng)藥活性［5］。在研究噻唑磷(thiazoline)的外消旋體及其對(duì)映異構(gòu)體對(duì)大型溞的水生急性毒性效應(yīng)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，其不同對(duì)映異構(gòu)體對(duì)大型溞的LC50值存在顯著差異，其中外消旋體在24 h 暴露試驗(yàn)中相對(duì)于其他對(duì)映異構(gòu)體顯示出了較低的毒性效應(yīng)［6］。在此基礎(chǔ)上，國(guó)內(nèi)外近年來先后建立了多種體內(nèi)、外研究模型，對(duì)手性農(nóng)藥多種毒理學(xué)效應(yīng)的對(duì)映體選擇性及其分子機(jī)理進(jìn)行了一系列研究［7，8］。針對(duì)手性農(nóng)藥對(duì)水生標(biāo)志生物的對(duì)映體選擇性毒性進(jìn)行了探討［9］。2007 年 Wang 等［10－11］對(duì)聯(lián)苯菊酯的研究發(fā)現(xiàn)，其 cis－BF 對(duì)大型溞的慢性毒性試驗(yàn)結(jié)果表現(xiàn)出對(duì)映體選擇性:即1R－cis－BF 的慢性毒性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于1S－cis －BF，在7 d 及14 d 的慢性暴露試驗(yàn)中，1S－cis－BF 對(duì)大型溞的存活率及繁殖力的最小有效濃度(MED)分別為1R －cis －BF 的40 和80 倍，且大型溞對(duì) 1R － cis－ BF 的生物累積作用是 1S － cis － BF 的 14 ～ 40 倍，其中 1R － cis － BF 在環(huán)境中的代謝速率相對(duì)1S－cis－BF 較慢可能是其富集濃度差異的原因之一［12］;2005 年Liu 等［13］發(fā)現(xiàn)氟蟲腈對(duì)網(wǎng)紋水溞的毒性也存在對(duì)映體選擇性，其(+)－氟蟲腈及其外消旋體對(duì)網(wǎng)紋水蚤的慢性毒性顯著高于(－)－氟蟲腈。

喹禾靈在對(duì)映體水平的毒理數(shù)據(jù)并不充分，對(duì)水生生物手性選擇性毒性研究和環(huán)境安全評(píng)價(jià)研究尚未見報(bào)道。本文選用大型溞進(jìn)行試驗(yàn)，研究喹禾靈及精喹禾靈對(duì)大型溞的急性毒性，以及對(duì)大型溞進(jìn)行慢性毒性試驗(yàn)，觀察大型溞相關(guān)的生物學(xué)參數(shù)(如存活率、生長(zhǎng)速度、產(chǎn)卵量以及有關(guān)的生化指標(biāo))的變化區(qū)別。目的在于探討喹禾靈在對(duì)映體水平上對(duì)水生生物毒性的手性選擇性，為準(zhǔn)確、全面地進(jìn)行農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)，為農(nóng)藥對(duì)映體的篩選和安全性評(píng)價(jià)提供準(zhǔn)確合理的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藥劑

精喹禾靈(quizalofop－P)95%原藥和喹禾靈(quizalofop －ethyl)90%原藥，均由江山農(nóng)藥有限公司提供;其他試劑均為分析級(jí)或生物級(jí)試劑。

1.2 試驗(yàn)生物

大型溞(Daphnia magna straus)系從農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所生測(cè)中心引種的62 D.M 純品系生物株，在試驗(yàn)室培養(yǎng)3 代以上。飼養(yǎng)密度為每50 mL 培養(yǎng)液1 只母溞。一星期更換2 ～3 次培養(yǎng)液。每天喂食斜生柵藻(Scemedesmus subspicatus)。投餌密度為每 l mL 含 2.0 ×105～3.0 ×105個(gè)藻類細(xì)胞。試驗(yàn)前挑選出生6 ～24 h 的健康活潑的幼溞用于毒性試驗(yàn)［14］。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 大型溞48 h 急性毒性試驗(yàn) 參考OECD(1984)標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)方法［15］進(jìn)行。設(shè)置5 個(gè)系列試驗(yàn)濃度、一個(gè)空白對(duì)照組和一個(gè)最大助劑濃度對(duì)照組，每個(gè)濃度4 個(gè)平行組，每個(gè)燒杯中放10 只個(gè)體均勻的6 ～24 h 的幼溞，水溫(20 ±2)℃。用曝氣水大于24 h 的稀釋水配制成不同濃度的試驗(yàn)溶液(pH 7.5 ±0.5)，保持光照與黑暗比16∶ 8，試驗(yàn)期間不投放餌料，不更換試驗(yàn)溶液，48 h 后觀察大型溞存活狀況并記錄試驗(yàn)結(jié)果。

1.3.2 大型溞21 d 慢性毒性試驗(yàn) 慢性毒性試驗(yàn)參考OECD 標(biāo)準(zhǔn)方法［15］，試驗(yàn)濃度設(shè)置以急性48 h－EC50和預(yù)試驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，設(shè)置一個(gè)空白對(duì)照組和一個(gè)助劑最大濃度對(duì)照組，以及5 個(gè)濃度水平。精喹禾靈和喹禾靈濃度依次為 0.062 5，0.125，0.25，0.50 mg/L;每個(gè)濃度 10 個(gè)平行組。試驗(yàn)溶液用曝氣24 h 以上的稀釋水配制，每個(gè)燒杯中盛放40 mL 試驗(yàn)溶液，每個(gè)燒杯中放2 只6 ～24 h 的幼蚤。試驗(yàn)期間采用半靜態(tài)試驗(yàn)系統(tǒng)，用新鮮的柵藻(2.0 ×105～3.0 ×105mL－1)喂養(yǎng)大型溞。每隔一天更換1 次試驗(yàn)溶液，保證試驗(yàn)期間藥劑濃度為起始濃度的80%以上。

試驗(yàn)期間每24 h 觀察1 次，取出新生幼溞，紀(jì)錄母溞第一次產(chǎn)卵時(shí)間、第一次產(chǎn)卵數(shù)、第三次產(chǎn)卵時(shí)間、第三次產(chǎn)卵數(shù)以及整個(gè)試驗(yàn)過程中的產(chǎn)卵次數(shù)、總產(chǎn)卵數(shù)、母溞脫皮次數(shù)等，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)在顯微鏡下測(cè)量其體長(zhǎng)(從頭盔至殼刺部的長(zhǎng)度)。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理 用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS12.0 計(jì)算急性毒性試驗(yàn)的LC50的值和95%置信限。酶活性測(cè)定結(jié)果用SPSS 16.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，各濃度組酶活性數(shù)據(jù)與空白組的比較采用 AVONA － Dunnent 檢驗(yàn);P ＜0.05 認(rèn)為存在顯著差異(*)，P ＜0.01 存在極顯著差異(＊＊)。大型溞慢性毒性試驗(yàn)所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示，并采用變異分析(ANOVA)和Duncan 檢驗(yàn)法統(tǒng)計(jì)分析，用SPSS12.0 軟件進(jìn)行顯著性分析，P ＜0.05，比較對(duì)照組和藥劑處理組之間的區(qū)別。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 喹禾靈和喹禾靈對(duì)大型溞的48 h 急性毒性

從表1 可以看出，喹禾靈和精喹禾靈對(duì)大型溞的48 h 急性毒性均為中等毒。

表1 喹禾靈和精喹禾靈對(duì)大型溞的急性毒性Tab.1 The acute toxicity of difenoconazle to Quizalofop-ethyl and Quizalofop-P

2.2 精喹禾靈和喹禾靈對(duì)大型溞的21 d 慢性毒性試驗(yàn)結(jié)果

精喹禾靈(亞致死劑量)對(duì)大型溞F0代母溞的存活、生長(zhǎng)以及繁殖等影響情況見表2 和表3。試驗(yàn)中所用的指標(biāo)均為亞致死濃度農(nóng)藥對(duì)大型溞產(chǎn)生影響的毒性指標(biāo)。

在整個(gè)試驗(yàn)周期內(nèi)，對(duì)照組(包括空白和丙酮)均未發(fā)現(xiàn)冬卵現(xiàn)象，但是喹禾靈在高濃度0.50 mg/L 時(shí)出現(xiàn)雄溞，如圖1(右)，且部分蛻皮出現(xiàn)異常，即蛻不完整，如圖2。母溞產(chǎn)第一胎后，在顯微鏡下觀察幼溞，未發(fā)現(xiàn)異常，如圖3。由表2 和3 可知，精喹禾靈和喹禾靈對(duì)大型溞的產(chǎn)卵時(shí)間、產(chǎn)卵數(shù)以及母溞脫皮次數(shù)、體長(zhǎng)均有不同程度的影響，現(xiàn)將結(jié)果分析如下:(1)經(jīng)藥劑處理后，大型溞的脫皮次數(shù)明顯減少，在濃度低于0.125 mg/L 時(shí)，兩種藥劑對(duì)大型溞脫皮的影響基本一致，但當(dāng)濃度高于0.25 mg/L 時(shí)，精喹禾靈對(duì)大型溞脫皮影響更為明顯;(2)然而，精喹禾靈和喹禾靈對(duì)大型溞產(chǎn)卵時(shí)間和產(chǎn)卵數(shù)的影響恰恰與對(duì)脫皮影響相反，經(jīng)精喹禾靈和喹禾靈處理后，產(chǎn)卵時(shí)間均明顯延后，產(chǎn)卵數(shù)也明顯受到抑制，精喹禾靈濃度在0.062 5 mg/L 以上時(shí)第一次產(chǎn)卵時(shí)間明顯延后，并且當(dāng)濃度達(dá)到0.25 mg/L 時(shí)，大型溞的產(chǎn)卵數(shù)明顯受抑制;濃度在0.25 mg/L 時(shí)產(chǎn)卵總量和母溞產(chǎn)卵胎數(shù)較對(duì)照組(包括空白組和丙酮組)明顯減少;喹禾靈藥劑處理組第一次產(chǎn)卵時(shí)間與對(duì)照組相比差異顯著，并且濃度越高，差異越顯著;當(dāng)濃度大于0.25 mg/L 時(shí)，第三次產(chǎn)卵時(shí)間明顯延后，產(chǎn)生后代幼溞的個(gè)數(shù)和胎數(shù)隨濃度升高也明顯減少;濃度高于0.25 mg/L 時(shí)，喹禾靈對(duì)大型溞產(chǎn)卵時(shí)間的延后以及產(chǎn)卵數(shù)的抑制作用較精喹禾靈更為明顯。(3)此外，精喹禾靈和喹禾靈對(duì)大型溞的體長(zhǎng)也具有一定的影響，藥劑處理組大型溞母溞的體長(zhǎng)與對(duì)照組相比差異顯著，但兩種藥劑之間的差異不大，不同濃度的處理組之間差異也不明顯。

表2 不同濃度的精喹禾靈作用下F0 代大型溞生長(zhǎng)和繁殖指標(biāo)的變化Tab.2 Growth and fecundity of F0 generation of D.magna exposed to Quizalofop-P in 14 -day life study

圖1 大型溞雌溞(左)和雄溞(右)Fig.1 Male (left)and female (right)D.magna

圖2 大型溞蛻皮異常，蛻不完整Fig.2 The D.magna that the exuvia in abnormal

圖3 大型溞正常成熟個(gè)體(已懷卵)Fig.3 The normal mature D.magna (the breeding one)

3 討論與結(jié)論

精喹禾靈和喹禾靈對(duì)大型溞均為中毒，精喹禾靈毒性高于喹禾靈?？梢娋天`對(duì)于水生生物的毒性高于喹禾靈。

喹禾靈與精喹禾靈對(duì)大型溞21 d 慢性毒性試驗(yàn)，對(duì)照組(包括空白和丙酮)均未發(fā)現(xiàn)冬卵現(xiàn)象，但是喹禾靈在高濃度0.50 mg/L 時(shí)出現(xiàn)的雄溞，母溞產(chǎn)第一胎后，在顯微鏡下觀察幼溞，未發(fā)現(xiàn)異常;精喹禾靈和喹禾靈對(duì)大型溞的產(chǎn)卵時(shí)間、產(chǎn)卵數(shù)以及母溞脫皮次數(shù)均有不同程度的影響，且二者在脫皮次數(shù)、產(chǎn)卵時(shí)間和產(chǎn)卵數(shù)等方面有顯著差異，對(duì)于大型溞體長(zhǎng)差異不大、不同濃度的處理組之間差異不明顯。經(jīng)精喹禾靈和喹禾靈處理后，產(chǎn)卵時(shí)間均明顯延后，產(chǎn)卵數(shù)也明顯受到抑制，精喹禾靈濃度在0.062 5 mg/L 以上時(shí)第一次產(chǎn)卵時(shí)間明顯延后，并且當(dāng)濃度達(dá)到0.25 mg/L 時(shí)，大型溞的產(chǎn)卵數(shù)明顯受抑制;喹禾靈藥劑處理組第一次產(chǎn)卵時(shí)間與對(duì)照組相比差異顯著，并且濃度越高，差異越顯著;當(dāng)濃度大于0.25 mg/L 時(shí)，第三次產(chǎn)卵時(shí)間明顯延后，產(chǎn)生后代幼溞的個(gè)數(shù)和胎數(shù)隨濃度升高也明顯減少;由此可見，大型溞的生物學(xué)參數(shù)之間是相互影響相互關(guān)聯(lián)的。精喹禾靈和喹禾靈不同程度的影響了母代大型溞的蛻皮、繁殖等生物學(xué)指標(biāo)，處理組大型溞產(chǎn)生后代的總數(shù)明顯低于對(duì)照組，由此可見化學(xué)品通過影響個(gè)體的生存和繁殖抑制了水溞種群動(dòng)力學(xué)。結(jié)果表明，手性農(nóng)藥的水生慢性毒性對(duì)映體選擇性可能與水生生物的選擇性吸收等生理過程有關(guān)［16］。

研究發(fā)現(xiàn)，精喹禾靈和喹禾靈對(duì)大型溞的產(chǎn)卵量及卵的孵化有明顯的影響，隨著濃度的升高，時(shí)間的延長(zhǎng)，影響也隨之變明顯，二者影響程度不同。尤其是對(duì)卵的孵化的影響，由于試驗(yàn)開始是未預(yù)測(cè)到該項(xiàng)指標(biāo)，沒有將該指標(biāo)納入觀測(cè)指標(biāo)之列，加之卵出現(xiàn)的時(shí)間短，個(gè)體小，沒有引起足夠重視，以至于開始時(shí)沒有記錄開始出現(xiàn)的未孵化卵的個(gè)數(shù)，但可以明顯觀察到隨著濃度的升高和時(shí)間的延長(zhǎng)，卵的數(shù)量明顯減少，對(duì)此可以做進(jìn)一步研究。

喹禾靈和精喹禾靈對(duì)大型溞的慢性毒性試驗(yàn)結(jié)果也表現(xiàn)出對(duì)映體選擇性。喹禾靈和精喹禾靈對(duì)大型溞毒性效應(yīng)差異的機(jī)理還需深入研究，尤其是通過分子毒理學(xué)的方法尋找導(dǎo)致效應(yīng)差異的目標(biāo)分子。

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