柏中中，孫家?jiàn)Z，吳 斌

（南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，江蘇南京211816）

D-乳酸是重要的手性中間體與有機(jī)合成原料，廣泛應(yīng)用于化工、高效低毒農(nóng)藥及除草劑、化妝品等領(lǐng)域的手性合成。近年來(lái)，高光學(xué)純度的D-乳酸因其在提高聚乳酸材料性能方面的實(shí)際應(yīng)用而得到了更多的關(guān)注[1]。目前D-乳酸的工業(yè)生產(chǎn)主要采用微生物發(fā)酵法。產(chǎn)光學(xué)純D-乳酸的微生物主要分布在乳桿菌屬（Lactobacillus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、芽孢乳桿菌屬（Sporolactobacillus）和明串珠菌屬（Leuconostoc）[2]。與L-乳酸發(fā)酵生產(chǎn)相比，D-乳酸在發(fā)酵菌種的多樣性及發(fā)酵水平方面仍具有較大的差距[3]，因此進(jìn)一步改良D-乳酸的生產(chǎn)菌株對(duì)于擴(kuò)大乳酸產(chǎn)品的種類和應(yīng)用領(lǐng)域具有重要的意義。

誘變育種是工業(yè)上提高菌種性能的常用手段。近年來(lái)，研究者已利用化學(xué)誘變劑、紫外照射及低能離子注入等方法進(jìn)行D-乳酸高產(chǎn)菌株的選育[4-6]。常壓室溫等離子體（ARTP）具有射流溫度低、產(chǎn)生的等離子體均勻、與生物大分子和細(xì)胞作用明顯等優(yōu)點(diǎn)，是快速突變微生物基因組的有效方法。目前已應(yīng)用于鏈霉菌、茂源鏈輪絲菌及木葡糖酸醋桿菌等微生物的誘變選育[7-9]，但尚未有利用ARTP誘變選育D-乳酸生產(chǎn)菌的報(bào)道。

在前期研究過(guò)程中，本課題組采用離子束誘變選育獲得一株D-乳酸穩(wěn)定高產(chǎn)菌Sporolactobacillus sp.Y2-8。該菌株搖瓶產(chǎn)酸量達(dá)120～140g/L，但發(fā)酵過(guò)程中菌體的比生長(zhǎng)速率和乳酸產(chǎn)率均相對(duì)較低（搖瓶發(fā)酵時(shí)間150～160h）[6]，過(guò)長(zhǎng)的發(fā)酵時(shí)間增加了生產(chǎn)成本及發(fā)酵過(guò)程中的染菌幾率。本研究以Y 2-8為出發(fā)菌株，利用ARTP選育高產(chǎn)量、高發(fā)酵速率的突變株，為D-乳酸的發(fā)酵生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

芽孢乳桿菌Sporolactobacillus sp.Y2-8（CCTCC No：M 208052） 由本實(shí)驗(yàn)室選育獲得；酵母粉、蛋白胨、葡萄糖、瓊脂粉等試劑 均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；玉米漿 取自安徽豐原發(fā)酵技術(shù)工程研究有限公司。

常壓室溫等離子生物育種機(jī) 北京思清源生物技術(shù)有限公司；U-3000型高效液相色譜儀 美國(guó)熱電公司；SBA-40型生物傳感儀 山東省科學(xué)院生物研究所；雷磁PHS-3E型pH計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基組成及培養(yǎng)方法 固體培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖20，酵母膏2，蛋白胨2，玉米漿2m L/L，KH2PO41，CH3COONa 2，MgSO40.2，瓊脂20，pH 7.0。

種子培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖20，酵母膏2，蛋白胨2，玉米漿2m L/L，MgSO40.2，麩皮2，CaCO314，pH 7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖150，酵母膏5，玉米漿15m L/L，MgSO40.5，麩皮15，CaCO390，pH 7.0。

高糖-溴甲酚綠篩選平板（g/L）：葡萄糖150，溴甲酚綠0.1，其他組成酵母膏、蛋白胨、玉米漿等組分及其含量與固體培養(yǎng)基組成相同。將生長(zhǎng)于固體平板上的菌種接入種子培養(yǎng)基，石蠟液封，搖床轉(zhuǎn)速180r/m in，37℃條件下培養(yǎng)14h，然后以10%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，石蠟液封，37℃下培養(yǎng)至培養(yǎng)基固化，記錄發(fā)酵時(shí)間。

1.2.2 ARTP誘變方法 本研究利用高純氦氣作為工作氣體，通氣量為10L/m in，功率為100W，照射距離2mm，處理菌液10μL。誘變過(guò)程的可變操作參數(shù)是處理時(shí)間，為了尋找最佳的誘變條件，首先需要獲得菌株的致死率曲線，因此處理時(shí)間從5s，依次增加到180s，然后將處理的樣品稀釋涂平板，利用平板計(jì)數(shù)法計(jì)算致死率[8]，選擇合適的誘變時(shí)間。

總之，基層行政事業(yè)單位財(cái)務(wù)管理工作是一項(xiàng)日常性工作，也是一項(xiàng)十分重要的工作。做好這項(xiàng)工作，基層行政事業(yè)單位必須鎖定財(cái)務(wù)管理重要性意識(shí)鎖，鎖住人才建設(shè)這把鎖，掛好財(cái)務(wù)管理目標(biāo)鎖，用好財(cái)務(wù)內(nèi)控管理這把鎖，定好財(cái)務(wù)管理職責(zé)這把鎖，才能用這些鎖把好財(cái)務(wù)活動(dòng)這扇大門，防范財(cái)務(wù)風(fēng)險(xiǎn)于未然。

1.2.3 高通量篩選方法 本研究利用高糖-溴甲酚綠平板作為篩選平板。將誘變后的菌株稀釋涂布于高糖-溴甲酚綠平板，37℃厭氧培養(yǎng)，觀察菌落周圍培養(yǎng)基的顏色變化快慢，選取菌落周圍變色最早最明顯的單菌落進(jìn)行搖瓶發(fā)酵復(fù)篩[6]。

1.2.4 突變株發(fā)酵性能篩選 選取目標(biāo)菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，比較突變株與原始菌在生物量、葡萄糖消耗量及產(chǎn)D-乳酸性能等方面的差異。

1.2.5 其他分析方法

1.2.5.1 生物量測(cè)定 收集發(fā)酵液靜置5m in，小心吸取0.5m L上層清液于試管中，適當(dāng)稀釋后檢測(cè)660nm處吸光值，乘以稀釋倍數(shù)得到菌株生物量OD660。

1.2.5.2 D-乳酸定量分析 采用高效液相色譜進(jìn)行分析，以檸檬酸為內(nèi)標(biāo)物（該菌發(fā)酵液中不含檸檬酸，添加量10g/L）。色譜柱，Chromasil C18（Allteck）。流動(dòng)相，2.5mmol/L NH4H2PO4溶液，流速為0.5m L/m in，柱溫為30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)230nm。

D-乳酸產(chǎn)量的標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=1.668X-0.0043，R2= 0.99992，式中，X：產(chǎn)物D-乳酸與內(nèi)標(biāo)檸檬酸的峰面積比值；Y：對(duì)應(yīng)的產(chǎn)物D-乳酸的濃度（g/L）。

D-乳酸產(chǎn)率按下式計(jì)算：Y=C/T。式中，Y：D-乳酸產(chǎn)率；C：D-乳酸濃度；T：發(fā)酵時(shí)間。

1.2.5.4 D-乳酸的光學(xué)純度分析 采用高效液相色譜法進(jìn)行測(cè)定，層析柱為Sum ichiral CA 5000，柱溫35℃。流動(dòng)相，1mmol/L CuSO4溶液，流速為1m L/m in，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm，分析結(jié)果與D-乳酸、L-乳酸標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖進(jìn)行比較。

1.2.5.5 葡萄糖含量測(cè)定 采用SBA-40型生物傳感器測(cè)定發(fā)酵液中殘留葡萄糖的濃度。

1.2.6 遺傳穩(wěn)定性分析 將復(fù)篩所得的高性能菌株在固體平板上進(jìn)行6代傳代培養(yǎng)，搖瓶發(fā)酵分析其產(chǎn)D-乳酸的性能。

2 結(jié)果與討論

2.1 ARTP誘變Sporolactobacillus sp.Y2-8的致死率曲線測(cè)定

利用ARTP對(duì)菌株Y2-8進(jìn)行等離子體注入誘變，考察不同注射時(shí)間對(duì)菌株致死率的影響。由圖1可知，等離子體處理時(shí)間與菌株Y2-8的致死率之間存在著明顯的效應(yīng)關(guān)系，隨著照射時(shí)間的延長(zhǎng)，菌株死亡率迅速增加。在處理60s時(shí)，菌株的死亡率為89.2%，處理90s時(shí)，菌致死率為95.6%，處理120s以后致死率接近100%。突變具有隨機(jī)性，目前菌株致死率與正突變之間的關(guān)系仍不十分明確，但大量實(shí)驗(yàn)表明[7-8，10]，致死率在95%左右，可獲得較好的正向突變率。因此本研究選用90s作為菌株誘變的處理時(shí)間。

圖1 不同照射時(shí)間下的致死率曲線Fig.1 Variation of the lethal rate of Sporolactobacillus sp.Y2-8 with the ARTP treatment time

2.2 高產(chǎn)酸速率突變株的快速篩選

高通量篩選是獲取目標(biāo)菌株的重要步驟之一。本實(shí)驗(yàn)室在前期的研究過(guò)程中，建立了高糖-溴甲酚綠篩選平板[6]，通過(guò)比較溴甲酚綠平板上變色圈產(chǎn)生的時(shí)間、大小和亮度，篩選獲得11株變色圈產(chǎn)生時(shí)間較早且較亮的突變株。而后比較該11株突變株與原始菌在篩選平板上產(chǎn)生變色圈的大小與時(shí)間差異，最終獲得了3株目標(biāo)菌株。分別命名為Y90s-1、Y90s-2和Y90s-3。

2.3 突變株的發(fā)酵性能考察

為進(jìn)一步了解篩選獲得的3株突變株的培養(yǎng)特性，本研究通過(guò)考察3株突變株在搖瓶發(fā)酵過(guò)程中的OD值、發(fā)酵液pH、D-乳酸產(chǎn)量及殘?zhí)橇孔兓?，比較突變株與原始菌的發(fā)酵性能差異，結(jié)果如圖2～圖5所示。由圖2可知，突變株Y90s-1的生長(zhǎng)明顯較突變株Y90s-2、Y90s-3及原始菌旺盛，發(fā)酵108h后，菌株Y90s-1的OD值達(dá)到13.7，而原始菌的OD值為9.7。同時(shí)該突變株在發(fā)酵初期pH下降也較快，說(shuō)明與其他三株菌相比，突變株Y90s-1產(chǎn)生了更多的乳酸，而后隨著發(fā)酵的進(jìn)行，游離乳酸與中和劑CaCO3反應(yīng)生成中性乳酸鈣，使發(fā)酵液的pH基本維持在4.5～5之間（圖3）。從圖4可見(jiàn)，突變株Y90s-1發(fā)酵過(guò)程中的耗糖速率也明顯快于原始菌和突變株Y90s-2、Y90s-3。進(jìn)一步比較突變株與原始菌發(fā)酵產(chǎn)D-乳酸的效率，結(jié)果見(jiàn)圖5。在菌株發(fā)酵過(guò)程中，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，D-乳酸濃度不斷增加，乳酸鈣的含量也不斷增加。當(dāng)乳酸鈣的含量超過(guò)此發(fā)酵溫度下乳酸鈣的飽和濃度時(shí)，D-乳酸開(kāi)始析出，最終整個(gè)發(fā)酵液固化。突變株Y90s-1在發(fā)酵116h后，整個(gè)發(fā)酵液固化，D-乳酸的濃度為122.4g/L，產(chǎn)率為1.05g/（L·h）。原始菌Y2-8的發(fā)酵固化時(shí)間為156h，D-乳酸的濃度為118.4g/L，產(chǎn)率為0.77g/（L·h）。突變株Y90s-1的發(fā)酵時(shí)間比原始菌縮短了40h，其D-乳酸生產(chǎn)強(qiáng)度比原始菌提高了36.3%。

圖2 原始菌和突變株的生長(zhǎng)曲線Fig.2 The growth curves ofwild strain and mutants

圖3 原始菌與突變株發(fā)酵液pH變化Fig.3 pH of the broth ofwild strain and mutants

圖4 原始菌與突變株的殘?zhí)橇縁ig.4 Fermentation residual sugar ofwild strain andmutants

圖5 原始菌與突變株的D-乳酸產(chǎn)量Fig.5 Fermentation yield of D-lactic acid ofwild strain and mutants

2.4 產(chǎn)物的光學(xué)純度分析

利用手性柱分析突變株Y90s-1發(fā)酵產(chǎn)物的光學(xué)純度（圖6），結(jié)果表明菌株Y90s-1發(fā)酵所產(chǎn)的D-乳酸光學(xué)純度達(dá)到了99.9%。

圖6 乳酸標(biāo)準(zhǔn)品及發(fā)酵液樣品的HPLC圖Fig.6 HPLC chromatogram analysis of the standard of lactic acid and fermentation sample

2.5 遺傳穩(wěn)定性分析

為檢測(cè)突變株Y90s-1的遺傳穩(wěn)定性，傳代過(guò)程中對(duì)各代的突變株進(jìn)行D-乳酸產(chǎn)量及發(fā)酵時(shí)間檢測(cè)。從1～6代，D-乳酸的產(chǎn)量及發(fā)酵時(shí)間均保持穩(wěn)定（圖7），結(jié)果表明，ARTP誘變選育的菌株Y90s-1保持著良好的遺傳穩(wěn)定性。

圖7 Y90s-1的遺傳穩(wěn)定性Fig.7 The analysis of genetic stability formutant Y90s-1

3 結(jié)論

本研究采用ARTP誘變選育高發(fā)酵速率的D-乳酸產(chǎn)生菌，這種誘變方法在D-乳酸產(chǎn)生菌選育中首次應(yīng)用，取得了良好的效果。篩選得到一株發(fā)酵速率提高了36.3%的突變株Y90s-1，并通過(guò)傳代實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了該突變株具有良好的遺傳穩(wěn)定性。本研究為D-乳酸產(chǎn)生菌的性能改良提供了一條新途徑。

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