王 歡，馮紅霞，張雅娜，王 妍，李 楊，江連洲，王 晶

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030）

大豆分離蛋白形成乳化液后，形成的保護層可以防止油滴聚集和乳化狀態(tài)的破壞，即大豆蛋白乳化穩(wěn)定性[1-3]。蛋白形成的乳化體系性質(zhì)除了受蛋白分子本身的性質(zhì)影響還受各種外界因素的影響[4]。磷脂的疏水的脂肪酸基團朝向空氣，親水的甘油磷酸酯基朝向水面排列，降低水油間的界面張力，從而有利于形成均一穩(wěn)定的乳化液[5-6]。磷脂中各組分的含量對其乳化性有一定影響[7-9]。

磷脂與蛋白復(fù)合，由于磷脂的特殊結(jié)構(gòu)，可以改變蛋白在水中的分散性能，防止結(jié)團[10-11]。Comas[12]提出不同存在狀態(tài)的大豆蛋白質(zhì)單獨存在或與卵磷脂交聯(lián)；Taha采用不同的變性劑，高壓滅菌和極端pH處理，在添加變性蛋白質(zhì)的氧化油中會形成更多的脂質(zhì)-蛋白質(zhì)復(fù)合物[13-14]。

近年來，我國豆制品行業(yè)不斷發(fā)展，大豆食品作為健康食品在全球市場的消費趨熱。由于大豆蛋白質(zhì)與磷脂均具有良好的乳化性能，使傳統(tǒng)豆制品如豆腐、豆奶、豆?jié){等在加工中極易形成乳化體系，乳化體系界面特征直接關(guān)系到產(chǎn)品口感、貨架期、應(yīng)用等。而在實際生產(chǎn)加工過程中，pH對產(chǎn)品的質(zhì)量有一定的顯著影響。因此，全面探究pH對大豆蛋白-磷脂乳化體系的共建機制的影響，為有效解決傳統(tǒng)豆制品加工中產(chǎn)生的“乳化體系調(diào)控”瓶頸問題提供理論指導(dǎo)。

本文以大豆分離蛋白、大豆磷脂及葵花油為原料，制備復(fù)合乳化體系，經(jīng)不同pH環(huán)境處理下對復(fù)合乳化體系的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆（東農(nóng)42） 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆研究中心；大豆磷脂 KAYON，上?？笊锛夹g(shù)有限公司；葵花油 超市購買；電泳Marker 無錫同創(chuàng)生化試劑公司；Tris 無錫同創(chuàng)生化試劑公司；NaHSO3、NaOH、Na2HPO4、鄰苯二甲酸氫鉀 分析純。

LW-1600FC紫外可見分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司；熒光正置顯微日本Nikon；激光粒度分析儀 BECKMAN COULTER；ES-2030冷凍干燥機 HITACHI4；PHS-3C雷磁pH計 上海精科；均質(zhì)機 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；LGR20-w高速低溫離心機 北京京立離心機有限公司；M ini-ProteinⅢ電泳儀 美國伯樂公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 制備大豆分離蛋白 大豆分離蛋白的傳統(tǒng)提取方法為堿提酸沉法[15-16]，主要利用大豆蛋白在高pH的情況下溶解度大，在等電點pH時溶解度最小的特點將其凝聚沉淀。

稱取足量的大豆，放入烘箱中烘干55℃干燥30m in；取出烘干后的大豆進行剝皮，用Polymix A10高速粉碎機粉碎，倒出粉碎大豆粉過篩（40目）。把過篩后的大豆粉均分在幾個三角瓶中，按1∶3比例加入正己烷，放在磁力攪拌器上攪拌30min。時間到后，將三角瓶中的固液混合物全部倒入大離心筒中，配平，用低速離心機離心（4000×g，15m in）。重復(fù)上述的磁力攪拌和離心操作三次以上，除去上層液體將固形物全部倒入大燒杯中，再置于通風(fēng)櫥中使正己烷完全揮發(fā)，既得脫脂豆粉備用。取適量脫脂豆粉與蒸餾水按1∶10比例在三角瓶中混合，加入NaOH調(diào)節(jié)pH至9，然后放在磁力加熱攪拌器上加熱攪拌50m in（50℃）。攪拌停止后，將三角瓶內(nèi)的混合物倒入離心筒中，配平，離心15m in（4000×g）。將離心筒中的上清液倒入燒杯中，逐滴加入HCl調(diào)至pH4.6，再將混合物離心分離，取沉淀，用NaOH調(diào)節(jié)pH至7，攪拌40m in，將調(diào)節(jié)完pH的蛋白均勻置于平皿內(nèi)，放入冷凍干燥機中進行冷凍干燥，既得成品大豆分離蛋白。

1.2.2 蛋白含量測定 采用凱氏定氮法測蛋白質(zhì)含量[17]。

1.2.3 凝膠電泳分析 采用SDS-PAGE電泳方法[17-20]。

1.2.4 大豆蛋白-磷脂復(fù)合乳化體系的制備 根據(jù)國內(nèi)外研究確定大豆蛋白-磷脂復(fù)合乳化體系中蛋白：磷脂（w/w）為10∶1。將一定量的大豆蛋白溶解在pH為7的緩沖液中[12，21]，常溫、磁力攪拌1h，加入大豆磷脂，繼續(xù)攪拌0.5h，將大豆蛋白、磷脂混合液倒入燒杯中，加入一定量的葵花油，在高速均質(zhì)機的作用下得到大豆蛋白-磷脂復(fù)合乳化體系[22]。測定乳化活性指數(shù)（EAI）和乳化穩(wěn)定性（ESI）。

1.2.4.1 大豆蛋白-磷脂復(fù)合乳化體系中蛋白濃度的確定 蛋白：磷脂（w/w）為10∶1，均質(zhì)條件：60s、20000r/m in，油相體積分數(shù)：25%，蛋白濃度：1、2、4、6、8、10、12、14、16mg/m L。

1.2.4.2 大豆蛋白-磷脂復(fù)合乳化體系中油相體積分數(shù)的確定 蛋白：磷脂（w/w）為10∶1，均質(zhì)條件：60s、20000r/m in，蛋白濃度：10mg/m L，油相體積分數(shù)：10%、15%、25%、30%、35%、40%。

1.2.4.3 大豆蛋白-磷脂復(fù)合乳化體系中均質(zhì)時間的確定 蛋白：磷脂（w/w）為10∶1，均質(zhì)轉(zhuǎn)數(shù)：20000r/m in，蛋白濃度：10mg/m L，油相體積分數(shù)：25%，均質(zhì)時間：20、30、40、50、60、120s。

1.2.5 理化因素指標(biāo)（pH）的選擇 制備pH 3～11的緩沖溶液[23]。pH 3～6緩沖液配制：檸檬酸-Na2HPO4（Mollvaine）緩沖液；pH7～9緩沖液配制：三羥甲基甲烷（Tris）-鹽酸緩沖液；pH 10緩沖液配制：甘氨酸-NaOH緩沖液；pH11緩沖液配制：磷酸緩沖液。

1.2.6 乳化體系性能指標(biāo)測定

1.2.6.1 乳化性的測定 將均質(zhì)后的乳狀液立即用0.1%的SDS溶液稀釋250倍，在500nm波長的紫外分光光度計測定吸光值計算乳化活性指數(shù)（EAI）[12，24-25]，靜置30m in后測定吸光值計算乳化穩(wěn)定性（ESI），公式如下：

式中：N：稀釋倍數(shù)（250）；C：乳化液形成前蛋白質(zhì)水溶液中蛋白質(zhì)濃度（g/m L）；φ：乳化液中油相體積分數(shù)；A0：0min時吸光值；A30：30min時吸光值。

1.2.6.2 粒徑分析 立即將均質(zhì)后的乳狀液慢慢滴入Malvern激光粒度分析儀的采樣裝置中測定粒度分布，測定溫度25℃[12]。

1.2.6.3 顯微鏡觀察 均質(zhì)后，立即將乳狀液至于載玻片上，蓋上蓋玻片，放置于熒光正置顯微鏡下，在100倍目鏡條件下觀察乳狀液的大小。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析 所有實驗數(shù)據(jù)均為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”，n=3，采用ORIGIN 8.5和SPSS統(tǒng)計分析軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 大豆分離蛋白SDS-PAGE電泳分析

根據(jù)凱氏定氮方法測得制備的大豆分離蛋白中蛋白含量為85.78%。圖1是大豆分離蛋白的SDSPAGE電泳圖譜。由圖1可知，1號譜帶為蛋白Marker，2號譜帶為制備的大豆分離蛋白，根據(jù)Scion Image掃描分析軟件分析得到大豆分離蛋白7S亞基含量約為37.1，11S亞基含量約為60.7。大豆分離蛋白中7S和11S比例約為2∶3。

圖1 大豆分離蛋白的SDS-PAGE圖譜Fig.1 SDS-polyacrylamide gel electrophoresis of SPI fractions

2.2 大豆蛋白-磷脂復(fù)合乳化體系的制備

2.2.1 蛋白濃度的確定 圖2、圖3分別為蛋白濃度對大豆蛋白-磷脂復(fù)合乳化體系的乳化活性指數(shù)和乳化穩(wěn)定性的影響。如圖2、圖3可見，隨著蛋白濃度的增加，復(fù)合乳化體系的乳化活性指數(shù)和穩(wěn)定性均增強，但當(dāng)?shù)鞍诐舛冗_到10mg/m L時，幅度趨于平緩，蛋白含量逐漸增多，磷脂的親水基團-甘油磷酸酯基朝向水面排列，可以降低水油間的界面張力，提高了復(fù)合體系的乳化性，當(dāng)?shù)鞍走_到一定濃度后蛋白和磷脂的混合達到了飽和狀態(tài)，乳化性能趨于平緩，在高濃度蛋白體系下，絮凝粒子之間間距很小，會通過氫鍵和膠體作用等方式相互作用。所以蛋白濃度選擇10mg/m L。

圖2 蛋白濃度對復(fù)合乳化體系EAI的影響Fig.2 The effectof protein concentration on the EAIof complex emulsion system

圖3 蛋白濃度對復(fù)合乳化體系ESI的影響Fig.3 The effect of protein concentration on the ESIof complex emulsion system

圖4 油相體積分數(shù)對復(fù)合乳化體系EAI的影響Fig.4 The effectof the oil phase volume fraction on the EAIof complex emulsion system

2.2.2 油相體積分數(shù)的確定 圖4、圖5為油相體積分數(shù)對大豆蛋白-磷脂復(fù)合乳化體系的乳化活性指數(shù)和乳化穩(wěn)定性的影響。如圖4、圖5可見，隨著油相體積的增加，復(fù)合乳化體系的乳化活性指數(shù)和乳化穩(wěn)定性增強，但當(dāng)?shù)鞍诐舛冗_到25%時，乳化活性指數(shù)趨于平緩，在40%時有所下降；穩(wěn)定性幅度趨于平緩，在35%處略有降低，40%時又有所升高；是由于隨著油相體積的增多，蛋白-磷脂復(fù)合乳化體系中蛋白和磷脂分子中親油基團更緊密的連接油相增加乳化體系的穩(wěn)定性。所以油相體積選擇25%。

圖5 油相體積分數(shù)對復(fù)合乳化體系ESI的影響Fig.5 The effectof the oil phase volume fraction on the EAIof complex emulsion system

2.2.3 均質(zhì)時間的確定 圖6、圖7分別為均質(zhì)時間對蛋白-磷脂復(fù)合乳化體系乳化活性指數(shù)和乳化穩(wěn)定性的影響。從圖6、圖7中可以看出，隨著均質(zhì)時間的延長乳化活性指數(shù)和乳化穩(wěn)定性均增強，當(dāng)達到30s后乳化穩(wěn)定性略有變化但趨于穩(wěn)定，和Comas等[12]研究結(jié)果相似。所以均質(zhì)時間選擇30s。

圖6 均質(zhì)時間對復(fù)合乳化體系的EAI的影響Fig.6 The effectof homogeneous time on the EAIof complex emulsion system

圖7 均質(zhì)時間對復(fù)合乳化體系的ESI的影響Fig.7 The effect of homogeneous time on the ESIof complex emulsion system

2.3 pH對乳化活性指數(shù)及穩(wěn)定性的影響

圖8、圖9為pH對蛋白-磷脂復(fù)合乳化體系的乳化活性和乳化穩(wěn)定性的影響。從圖8、圖9可見，在pH小于7時，乳化活性及乳化穩(wěn)定性均較低，在pH4時出現(xiàn)最低值；當(dāng)pH大于7時，隨著pH的增大，乳化活性及穩(wěn)定性均呈現(xiàn)緩慢增長趨勢，在pH11時又有小幅度的降低。在pH 4左右的乳化活性及穩(wěn)定性較低是因為此范圍在大豆分離蛋白的等電點附近，蛋白沉降聚集，電荷幾乎為0，親水和親油基團幾乎完全不能吸附水相和油相，此復(fù)合乳化體系中磷脂受pH影響較小，但磷脂含量較少所以不能抵制等電點對復(fù)合乳化體系的顯著影響。當(dāng)pH在中性及弱堿性環(huán)境下，乳化活性及穩(wěn)定性較好，在pH 11時，堿性較強，強堿環(huán)境開始對蛋白及磷脂結(jié)構(gòu)造成影響，故有下降趨勢。

圖8 pH對乳化活性指數(shù)（EAI）的影響Fig.8 The effectof different pH on the EAIof Soy protein-phospholipid complex emulsion system

圖9 pH對乳化穩(wěn)定性（ESI）的影響Fig.9 The ESIof Soy protein-phospholipid complex emulsion system with different pH

2.4 pH對乳化體系的粒徑分析影響劑顯微鏡觀察

圖10 不同pH條件下大豆蛋白-磷脂復(fù)合乳化體系的粒徑分布Fig.1 0 The effectofdifferent pH on the particle size distribution of Soy protein-phospholipid complex emulsion system

圖10為不同pH條件下大豆蛋白-磷脂復(fù)合乳化體系的粒徑分布，由圖8、圖9可知pH對大豆蛋白-磷脂復(fù)合乳化體系乳化性的影響，而粒徑分布是評價乳化性的另一個指標(biāo)，乳化活性越好，粒徑就越小。隨著pH的增大，粒徑曲線逐漸向左遷移，從圖10可見，在pH 3～6范圍內(nèi)粒徑大小在100～200μm內(nèi)較多，且pH 4時最多，在pH 7時粒徑大小多集中在40～50μm范圍內(nèi)，而pH8～11范圍內(nèi)時，粒徑均分布較小，且出現(xiàn)部分重疊現(xiàn)象，這些都與圖8、圖9的結(jié)論相似。

圖11為不同pH條件下大豆蛋白-磷脂復(fù)合乳化體系的顯微鏡觀察，由圖11可見，pH 3～6時乳化體系顆粒較大，小圓珠為油相，流動相為水相，蛋白和磷脂吸附在油水界面上，pH 7時的顆粒小于pH 3～6時的顆粒，且大于pH 8，pH 9～10顆粒最小，pH 11的顆粒略大于pH 9～10的。這些均與圖10的粒徑分布相符合。

圖11 不同pH條件下大豆蛋白-磷脂復(fù)合乳化體系的顯微鏡觀察Fig.1 1 Themicroscope of Soy protein-phospholipid complex emulsion system with different pH

綜上，乳化活性與乳化穩(wěn)定性均在pH小于7時較低，尤其是在pH 4左右最低，主要原因是此范圍處于大豆分離蛋白的等電點附近，電荷為0；pH大于7時，隨著pH的增加，乳化活性及乳化穩(wěn)定性呈現(xiàn)緩慢增加趨勢，通過粒徑分布圖及顯微鏡觀察也同時對上述現(xiàn)象進行了印證。

3 結(jié)論

本實驗中大豆分離蛋白，與大豆磷脂、葵花油在均質(zhì)機作用下制備復(fù)合乳化體系，以乳化活性指數(shù)和乳化穩(wěn)定性為指標(biāo)經(jīng)單因素實驗確定復(fù)合乳化體系制備參數(shù)：大豆分離蛋白∶大豆磷脂（w/w）=10∶1，水相∶油相（v/v）=3∶1，大豆分離蛋白含量為10mg/m L，均質(zhì)時間30s，均質(zhì)速度20000r/m in。乳化活性、乳化穩(wěn)定性、粒徑分析及顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，大豆蛋白-磷脂復(fù)合乳化體系在pH≥7環(huán)境下，乳化體系較穩(wěn)定，這種環(huán)境下的豆制品性能較好，為豆制品生產(chǎn)加工提供理論依據(jù)。

[1]李玉珍，肖懷秋，蘭立新.大豆分離蛋白功能特性及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用[J].中國食品添加劑，2008（1）：121-124.

[2]趙威祺.大豆蛋白質(zhì)的構(gòu)造和功能特性（中）[J].糧食與食品工業(yè)，2004，12（2）：3-6.

[3]劉紅玉，鄭惠枚，郝國東.大豆分離蛋白的生產(chǎn)工藝[J].農(nóng)機化研究，2002（2）：122-126.

[4]Wager J R.Surface functional properties of native，acidtreated and reduced soyglycinin.2.Emulsifying properties[J].J Agric Food Chem，1999，47（6）：2181-2187.

[5]陳海敏.大豆蛋白組成與功能關(guān)系研究[J].西部糧油科技，2001，26（3）：36-38.

[6]黃萍萍.大豆磷脂的酶法改性研究[D].廣州：暨南大學(xué)，2007.

[7]田志茗，韓志剛.羥化乙氧基化改性磷脂的合成與性能研究[J].化工時刊，2005，19（4）：5-6.

[8]馮玲琴.大豆改性磷脂的合成工藝及性能研究[D].南京：南京理工大學(xué)，2008.

[9]Kick O.Encyclpedia of chemical technology[J].American Chemical Society，1995（2）：58-61.

[10]王洪晶，華欲飛.大豆分離蛋白凝膠研究進展[J].糧食與油脂，2005（2）：3-5.

[11]顧振宇，降美都，付道才.大豆分離蛋白乳化性的研究[J].中國糧油學(xué)報，2000，15（3）：32-34.

[12]Comas D I，Wagner JR，Tomas M C.Creaming stability of oil in water（O/W）emulsions：Influence of pH on soybean protein-lecithin interaction[J].Food Hydrocolloids，2006，20（7）：990-996.

[13]FS T，SS M.Effect of different denaturating methods on lipid-protein complex formation[J].Swiss Society of Food Science and Technology，2004，37（1）：99-104.

[14]Angela S，Inta S.Physico-chemical characteristics of oilin-water emulsions based on whey protein-phospholipid mixtures[J].Colloids and Surfaces Biointerfaces，2001，21：75-85.

[15]宋鵬，魏安池，周瑞寶，等.不同工藝條件對大豆分離蛋白提取率的影響[J].中國油脂，2011，36（2）：16-19.

[16]宋佳，陳野，鄭曉晨，等.大豆11S和7S球蛋白提取工藝優(yōu)化研究[J].食品研究與開發(fā)，2013，34（2）：77-81.

[17]劉順湖，周瑞寶，蓋鈞鎰.大豆蛋白質(zhì)11S和7S組分及其亞基分析方法的研究述評[J].河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2007，28（4）：1-6.

[18]黃麗華.大豆種子貯藏蛋白11S和7S組分的研究[J].中國油料作物學(xué)報，2003，25（3）：20-23.

[19]王顯生.不同SDS-PAGE分離膠濃度條件下大豆貯藏蛋白亞基的分辨效果[J].中國油料作物學(xué)報，2004，26（2）：75-80.

[20]M Hao，W Xiansheng.The content variation of 7S，11S globulinsand their subunitsofseed storage protein of706 Chinese soybean germplasm[J].Soybean Science，2006，25（1）：11-17.

[21]張宏露，江連洲，胡少新.大豆蛋白乳化性研究進展[J].大豆科技，2011（1）：27-29.

[22]郭興鳳，慕運動，阮詩豐.不同測定方法對大豆分離蛋白乳化性測定結(jié)果的影響[J].食品研究與開發(fā)，2007，28（2）：129-131.

[23]王中江，江連洲，魏冬旭，等.pH對大豆分離蛋白構(gòu)象及表面疏水性的影響[J].食品科學(xué)，2012，33（11）：47-51.

[24]Chockry B.Interaction of a-lactalbumin with lipids and possible implications for its emulsifying properties：A review[J].International DairyJournal，2011，21（10）：727-741.

[25]Hirotsuka M，Taniguchi H，Narita H，et al.Increase in emulsification activity of soy lecithin-soy protein complex by ethanol and heat treatments[J].Journal of Food Science，1984，49：1105-1110.