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        仔豬潰瘍性結(jié)腸炎模型的建立

        2013-02-20 02:32:56王清靜朱惠玲丁斌鷹侯永清
        飼料工業(yè) 2013年19期
        關(guān)鍵詞:模型

        ■陳 星 王清靜 王 蕾 朱惠玲 丁斌鷹 侯永清

        (動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室武漢輕工大學(xué),湖北武漢 430023)

        潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative Colitis,UC)是一種主要累及結(jié)腸黏膜層和黏膜下層的非特異性炎癥。建立合適的動(dòng)物模型是研究UC發(fā)病機(jī)制和治療手段不可缺少的重要方法。化學(xué)誘導(dǎo)性結(jié)腸炎是比較廣泛使用的UC模型,常用誘導(dǎo)介質(zhì)有葡聚糖硫酸鈉(Dextran Sulfate soduium,DSS)、惡唑酮(oxazolone)、角叉菜膠、2,4,6-三硝基苯磺酸(Trinitrobenzene Sulfonic Acid,TNBS)和乙酸等。

        TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎目前已成為國(guó)際上較為理想的炎癥性腸病模型,此法可在大鼠、小鼠上成功誘導(dǎo)結(jié)腸炎。乙酸模型是上世紀(jì)70年代在胃與十二指腸潰瘍模型基礎(chǔ)上發(fā)展起來的UC模型,能夠在大鼠、家鼠、家兔和豚鼠等動(dòng)物上誘導(dǎo)產(chǎn)生急性彌散性UC。Khan等(1997)研究發(fā)現(xiàn)乙酸模型中結(jié)腸IL-1β mRNA表達(dá)增加,LTB4(白三烯B4)、PGE2(前列腺素E2)、TXB2(血栓素B2)在乙酸處理組均比正常對(duì)照組高,其中LTB4水平高達(dá)50倍,這些病理變化與人類UC在炎癥介質(zhì)方面非常相似。

        目前UC模型動(dòng)物以鼠為主,鮮有仔豬的潰瘍性結(jié)腸炎模型。我們擬在仔豬上建立一種簡(jiǎn)便易行、重復(fù)性好、穩(wěn)定的潰瘍性結(jié)腸炎模型??紤]到DSS的高成本和惡唑酮(oxazolone)、角叉菜膠的動(dòng)物特異性,所以本試驗(yàn)選用TNBS和乙酸作為誘導(dǎo)介質(zhì)進(jìn)行建模探索。

        1 材料和方法

        1.1 試驗(yàn)材料

        乙酸:純度≥99.5%,購自國(guó)藥集團(tuán);三硝基苯磺酸(TNBS):5%水溶液 (w/v),購自Sigma公司。

        1.2 試驗(yàn)動(dòng)物與方法

        1.2.1 試驗(yàn)動(dòng)物及分組

        取體重接近,健康的(35±3)日齡斷奶仔豬18頭,按表1隨機(jī)分成對(duì)照組、TNBS處理組和乙酸組。仔豬飼喂相同的玉米-豆粕型基礎(chǔ)日糧,預(yù)飼期3 d后正式試驗(yàn)。

        表1 試驗(yàn)動(dòng)物分組及處理方法

        1.2.2 模型制作方法

        參照Cetinkaya等(2006)用于大鼠的造模方法,各組仔豬灌注前36 h禁食不禁水,按30 mg/kg BW靜脈注射戊巴比妥鈉,麻醉15 min后開始灌腸。將豬左側(cè)臥位,將肛管輕輕旋轉(zhuǎn)插入肛門約25 cm,檢查有無糞塊堵塞。如有糞便則要用肥皂水洗腸,直至洗凈,再按劑量灌注TNBS、乙酸或生理鹽水,灌完后將豬倒立1 min后,將豬放回欄內(nèi),讓豬靜臥,隨后觀察并記錄結(jié)果。

        1.3 樣品采集

        在灌注3 d或7 d后,注射50 mg/kg戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉,15 min后屠宰,迅速取出結(jié)腸,沿腸系膜緣剪開腸腔,用生理鹽水沖洗內(nèi)容物,并用濾紙吸干,平鋪固定腸段,肉眼觀察形態(tài)改變。另取炎癥或潰瘍處結(jié)腸各取若干組織(10 mm×10 mm),4%甲醛固定,石蠟包埋,HE染色,制作病理切片觀察損傷變化。

        1.4 觀察指標(biāo)

        1.4.1 仔豬狀態(tài)與糞便情況

        灌腸后每天觀察仔豬精神狀態(tài)、采食量、糞便性狀及是否便血等情況。

        1.4.2 結(jié)腸黏膜損傷評(píng)分

        結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)(CMDI)的半定量標(biāo)準(zhǔn)參照Vilaseca等(1990)的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)加以調(diào)整,按表2所需評(píng)定指標(biāo)評(píng)分。

        表2 結(jié)腸黏膜損傷評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

        1.5 數(shù)據(jù)處理

        所得數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。肉眼觀察評(píng)分和病理組織學(xué)評(píng)分用t檢驗(yàn)進(jìn)行分析,P<0.05為差異有顯著性。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 仔豬狀態(tài)與糞便情況

        對(duì)照組灌注生理鹽水后,精神、采食正常,未出現(xiàn)稀便與便血。TNBS組6頭仔豬灌注25 mg/kg與50 mg/kg TNBS后,精神正常,采食略下降,出現(xiàn)稀便,第2 d即恢復(fù)。乙酸組3頭仔豬灌注5%乙酸后,精神、采食正常,出現(xiàn)短暫稀便即恢復(fù);6頭仔豬灌注10%乙酸后,倦怠懶動(dòng),后背微弓,推測(cè)有腹痛感,采食下降,出現(xiàn)稀便與膿血便,血便中可見腸黏膜脫落,血便第2 d消失,但仍有稀便,第3 d恢復(fù)。

        2.2 結(jié)腸黏膜損傷評(píng)分(見表3)

        表3 肉眼觀察評(píng)分和病理組織學(xué)評(píng)分

        對(duì)照組仔豬灌注生理鹽水后,屠宰采集結(jié)腸可見腸外壁沒有粘連,腸壁內(nèi)表面沒有潰瘍,腸壁沒有水腫,病理切片可見結(jié)腸黏膜炎性細(xì)胞沒有浸潤(rùn),無纖維化;TNBS組和5%乙酸組仔豬均只表現(xiàn)出腸外壁輕微粘連和輕微水腫,病理切片可見結(jié)腸黏膜炎性細(xì)胞輕度浸潤(rùn),輕度纖維化;而10%乙酸組仔豬灌注后3 d,腸外壁嚴(yán)重粘連和水腫,均出現(xiàn)潰瘍,病理切片可見結(jié)腸黏膜炎性細(xì)胞重度浸潤(rùn),重度纖維化,灌注后7 d有所恢復(fù)。

        病理切片組織學(xué)形態(tài)見圖1。對(duì)照組結(jié)腸黏膜皺襞紋理清晰,未見潰瘍,上皮完整、連續(xù),腺體排列規(guī)則、結(jié)構(gòu)清楚,無炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1A)。TNBS處理組和5%乙酸處理組仔豬肉眼觀察,僅可見輕微腸壁外周粘連,個(gè)別出現(xiàn)輕微水腫,病理觀察僅可見輕微炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1B);而10%乙酸灌腸3 d屠宰的結(jié)腸腸壁外周粘連嚴(yán)重,1頭出現(xiàn)1處約2 cm潰瘍?cè)?,另兩頭出現(xiàn)1處約1 cm潰瘍?cè)睿▓D1C),黏膜上皮壞死溶解脫落,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯,有大量淋巴細(xì)胞,多形核細(xì)胞,漿細(xì)胞,毛細(xì)血管充血,腸腺間質(zhì)出血(圖1D)。10%乙酸灌腸7 d屠宰的結(jié)腸切片中,可見潰瘍?cè)蠲撀洌▓D1E),仍有毛細(xì)血管充血,炎性細(xì)胞浸潤(rùn),但對(duì)比灌腸后3 d已明顯減少,另有大量成纖維細(xì)胞增生(圖1F)。

        由此可見,直腸灌注10%乙酸能成功誘導(dǎo)仔豬結(jié)腸炎。

        3 討論

        腸黏膜是機(jī)體與外界接觸的一道屏障,腸黏膜受損導(dǎo)致腸黏膜屏障功能破壞,引起腸道細(xì)菌移位和促炎性因子的大量釋放,從而加重原發(fā)疾病,甚至誘發(fā)多臟器器官功能紊亂。潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative Colitis,UC)和克隆恩?。–mhn'S dis?ease,CD)同屬于炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease,IBD),其病因可能涉及免疫、遺傳、環(huán)境等。目前報(bào)道的IBD誘導(dǎo)性動(dòng)物模型中,制模介質(zhì)有乙酸、TNBS(2、4、6-三硝基苯磺酸)、二硝基氯苯、惡唑酮、角叉菜膠、葡聚糖硫酸鈉等,有些因?yàn)橹颇7椒◤?fù)雜,造模介質(zhì)價(jià)格昂貴,或者模型與人IBD相差較遠(yuǎn),已日漸淘汰。

        TNBS模型主要制炎機(jī)制是乙醇作為有機(jī)溶劑可以溶解腸黏膜表面的黏液,破壞腸黏膜屏障,協(xié)助TNBS這種半抗原物質(zhì)滲入結(jié)腸組織與大分子組織蛋白結(jié)合,形成全抗原,引起腸壁一系列免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng),最終導(dǎo)致結(jié)腸炎癥的發(fā)生,出現(xiàn)血便與潰瘍等典型結(jié)腸炎癥狀。研究發(fā)現(xiàn),此模型炎癥持續(xù)時(shí)間長(zhǎng),MPO酶活性也呈相關(guān)性升高,各種炎癥介質(zhì)如 PGE2、TXB2、LTB4、6-keto-PGF、LTC4、PAF和IL也發(fā)生明顯的變化,與人類IBD類似。本研究中,采用直腸灌注25 mg/kg和50 mg/kg TNBS的50%乙醇溶液,均只出現(xiàn)短暫的稀便,病理切片觀察也只有輕微炎性癥狀,與正常對(duì)照組沒有顯著差異。說明此造模方法效果不佳,可能是由于豬與鼠的品種差異或者腸道結(jié)構(gòu)功能差異,對(duì)TNBS不敏感,不能誘導(dǎo)抗原性炎癥。

        乙酸誘導(dǎo)結(jié)腸炎模型是一種典型的化學(xué)誘導(dǎo)性炎癥模型,采用乙酸化學(xué)性刺激劑造成腸黏膜化學(xué)性損傷,繼而產(chǎn)生炎性癥狀。Fabia等(1992)在大鼠上選用4%、6%和8%濃度的乙酸直腸灌注,作用時(shí)間分別為10、15、20、25、30 s,乙酸體積均為2 ml,發(fā)現(xiàn)4%濃度作用15 s為最佳造模方法??紤]到豬腸道的高耐受性和代謝迅速的特點(diǎn),我們選用5%和10%的10 ml的乙酸直腸灌注1 min,結(jié)果發(fā)現(xiàn)5%乙酸達(dá)不到造模效果,而10%乙酸灌注的6頭仔豬的糞便性狀、結(jié)腸形態(tài)、組織學(xué)觀察均呈現(xiàn)出明顯的炎癥癥狀,同時(shí)通過造模3 d與7 d后的組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn),3 d后出現(xiàn)潰瘍?cè)?,并有明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等炎癥反應(yīng),而7 d后可見潰瘍?cè)钜衙撀?,炎性?xì)胞浸潤(rùn)明顯減少,大量成纖維細(xì)胞增生,說明炎癥正在恢復(fù)中。通過以上試驗(yàn)摸索,我們初步建立了仔豬乙酸性結(jié)腸炎模型,該模型方法簡(jiǎn)便,重復(fù)性好,個(gè)體差異小,這為研究豬和人類結(jié)腸炎制炎機(jī)理和治療方法提供一種有效手段。

        圖1 病理切片組織學(xué)形態(tài)

        4 結(jié)語

        綜上所述,直腸灌注乙酸可誘導(dǎo)仔豬結(jié)腸炎,簡(jiǎn)便易行,成本低,重復(fù)性好,但該模型在仔豬上只是進(jìn)行了初步摸索,其炎癥周期和制炎機(jī)理還需進(jìn)一步研究。

        (參考文獻(xiàn)11篇,刊略,需者可函索)

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