■林 俊 段智勇 羅 正

(建明工業(yè)（珠海）有限公司，廣東珠海 519040)

在國外，早在60、70年代就開始著手于枯草芽孢桿菌的研究與應(yīng)用，目前已廣泛地應(yīng)用于各種動(dòng)物養(yǎng)殖和工廠化的飼料生產(chǎn)中。我國雖起步較晚，但目前在枯草芽孢桿菌的作用機(jī)理和推廣與實(shí)際應(yīng)用方面取得了較快的進(jìn)展。國內(nèi)益生菌生產(chǎn)廠家已達(dá)上百家，菌種多樣，產(chǎn)品質(zhì)量也千差萬別，在這種歷史背景下，枯草芽孢桿菌類益生菌產(chǎn)品也存在質(zhì)量控制、檢測(cè)方法不統(tǒng)一，產(chǎn)品標(biāo)識(shí)不規(guī)范等問題，這些都有待改善和提高。

1 益生菌常用的檢測(cè)方法及存在問題

1.1 常用的幾種檢測(cè)方法

目前市場(chǎng)上的枯草芽孢桿菌類產(chǎn)品眾多，產(chǎn)品規(guī)格標(biāo)識(shí)不統(tǒng)一。有些產(chǎn)品標(biāo)的是活菌數(shù)，有些標(biāo)的孢子數(shù)，甚至還有些廠家的產(chǎn)品標(biāo)識(shí)值模棱兩可，標(biāo)識(shí)不明確導(dǎo)致飼料生產(chǎn)企業(yè)和養(yǎng)殖企業(yè)購買后使用困難或者效果不穩(wěn)定。例如，某些廠家銷售的枯草芽孢桿菌規(guī)格標(biāo)明“100億/g”的，但是100億個(gè)枯草芽孢桿菌并不等同于能產(chǎn)生100億個(gè)芽孢，有些不產(chǎn)芽孢的活菌高溫下會(huì)死亡；市面上有的產(chǎn)品標(biāo)識(shí)芽孢數(shù)為“100億/kg”，在實(shí)驗(yàn)室通過平板計(jì)數(shù)法等相關(guān)檢驗(yàn)方法也的確能夠檢測(cè)到這么多的芽孢數(shù)，但是因?yàn)樾螒B(tài)一樣，最終沒有辦法分辨出內(nèi)部包含有多少非芽孢的營養(yǎng)體和不完整的芽孢，更不能檢測(cè)出釋放的芽孢數(shù)是多少，這樣就會(huì)使生產(chǎn)出來的產(chǎn)品達(dá)不到配方設(shè)計(jì)時(shí)的芽孢數(shù)，所以效果會(huì)很不穩(wěn)定。一般出現(xiàn)這種問題，無法快速準(zhǔn)確找出原因所在，最終在客戶層面的結(jié)果是產(chǎn)品品質(zhì)差，公司層面認(rèn)為產(chǎn)品開發(fā)失敗。在我國，由于儀器設(shè)備和檢測(cè)方法的限制，一般多采用常規(guī)檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，如：平板稀釋計(jì)數(shù)法、顯微鏡測(cè)數(shù)法、濁度測(cè)定法等。①平板稀釋計(jì)數(shù)法是將待測(cè)樣品按設(shè)定比例稀釋，讓其中的單個(gè)細(xì)胞充分分散均勻，先后經(jīng)過接種，培養(yǎng)，形成肉眼可見的菌落（培養(yǎng)基表面生長的一個(gè)菌落來源于樣品稀釋液中的一個(gè)活菌）。計(jì)數(shù)其單一菌落個(gè)數(shù)從而換算出細(xì)菌總數(shù)，通過特定的染色手段還可以定量區(qū)分出活菌數(shù)。缺點(diǎn)是由于菌落容易生長在一起，導(dǎo)致結(jié)果容易偏低。②顯微鏡測(cè)數(shù)法是將細(xì)菌（或其他微生物）用染劑（例如結(jié)晶紫）染色后，直接以顯微鏡觀察方式計(jì)數(shù)，再推算回細(xì)菌數(shù)，所得即為總菌數(shù)，缺點(diǎn)是死菌、活菌共同計(jì)算，產(chǎn)品活菌的含量低于實(shí)際含量。③濁度測(cè)定是利用光電比色計(jì)在特定波長的條件下，通過含細(xì)菌（或其他微生物）的均勻懸濁液，測(cè)其吸收率或折射率。建立數(shù)據(jù)庫，利用回歸曲線迅速測(cè)出總菌數(shù)，缺點(diǎn)也是死菌、活菌一起計(jì)算，還會(huì)受到載體的干擾。

通過上面對(duì)三種測(cè)量方法的分析，不難看出，比較具有操作可行性的首推“平板稀釋計(jì)數(shù)法”，實(shí)際上“平板稀釋計(jì)數(shù)法”也是目前國內(nèi)最常用、最穩(wěn)定可靠的活菌計(jì)數(shù)。建明實(shí)驗(yàn)室在此基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化改進(jìn)，有效地分離即將粘連生長的多個(gè)細(xì)胞（結(jié)果見圖1、圖2），使檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確，從而保證飼料添加量一致，飼料品質(zhì)穩(wěn)定。

1.2 檢測(cè)中存在的常見問題

1.2.1 不同產(chǎn)品標(biāo)識(shí)數(shù)與實(shí)測(cè)數(shù)的不一致

由于計(jì)數(shù)方法的不統(tǒng)一，客戶基本不進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)時(shí)間長需要專人操作等原因，造成使用后產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定，不僅如此，很多益生菌生產(chǎn)企業(yè)也不對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。表1是建明公司用優(yōu)化的平板計(jì)數(shù)法對(duì)不同產(chǎn)品進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)的結(jié)果，從表1可以看出，不同的產(chǎn)品之間存在著很大的差異，產(chǎn)品A實(shí)際活菌數(shù)比檢測(cè)結(jié)果相差了300倍，而建明的產(chǎn)品孢子數(shù)比標(biāo)識(shí)的高0.5倍。所以在選擇益生菌時(shí)不能光看標(biāo)識(shí)，還要看檢測(cè)結(jié)果。

圖1 普通平板計(jì)數(shù)結(jié)果

圖2 優(yōu)化方法計(jì)數(shù)結(jié)果

表1 不同益生菌產(chǎn)品標(biāo)識(shí)數(shù)與實(shí)測(cè)數(shù)的對(duì)比

1.2.2 難以區(qū)分芽孢和營養(yǎng)體

芽孢桿菌采用有效芽孢數(shù)的計(jì)算方法，目的是為去除非芽孢的營養(yǎng)體和不完整的芽孢，保證芽孢數(shù)的準(zhǔn)確性。既然是枯草芽孢桿菌的檢驗(yàn)，一定會(huì)涉及到芽孢的概念，眾所周知，芽孢是在一定條件下，細(xì)胞質(zhì)高度濃縮脫水所形成的一種抗逆性很強(qiáng)的球形或橢圓形的休眠體所產(chǎn)生的孢子，耐酸堿、高溫和擠壓，在配合飼料制粒過程可以很好的加入到環(huán)模造粒機(jī)，單雙螺桿膨化機(jī)中進(jìn)行全價(jià)配合飼料的生產(chǎn)。

以往大家可能會(huì)認(rèn)為活菌數(shù)是衡量枯草芽孢桿菌產(chǎn)品的唯一指標(biāo)，但是在現(xiàn)代飼料制作過程中，以活菌存在的枯草芽孢桿菌制劑會(huì)受到來自飼料原料顆粒，如：豆粕、玉米、面粉、魚粉甚至多維多礦等眾多粉體原料的摩擦和擠壓，從而使菌體破裂導(dǎo)致死亡，尤其是在水產(chǎn)類飼料的生產(chǎn)過程中，經(jīng)過飽和蒸汽一次調(diào)質(zhì)，甚至二次調(diào)質(zhì)，再通過單螺桿膨化機(jī)，甚至雙螺桿膨化機(jī)擠壓膨化后，在膨化腔中會(huì)出現(xiàn)暫時(shí)的高溫，溫度有時(shí)會(huì)超過120℃，甚至更高，這樣的話損失就會(huì)更大。所以，對(duì)于要保證活菌數(shù)的市售枯草芽孢桿菌類產(chǎn)品來講，光有菌體是不行的，芽孢才是關(guān)鍵。

1.2.3 研發(fā)和生產(chǎn)過程中缺乏適當(dāng)?shù)钠房匾矔?huì)導(dǎo)致計(jì)數(shù)的失誤

關(guān)于芽孢桿菌最初篩選的來源，各大生產(chǎn)商也是大相徑庭：有的是從健康動(dòng)物腸道中經(jīng)過長期地反復(fù)篩選優(yōu)化得到的最初菌株；有些中間步驟就沒有那么細(xì)致，得到的純度大打折扣；還有一些通過合成的方法也能得到相關(guān)的菌株，也有幾個(gè)方面兼而有之的，總之在菌株的篩選上，各有各的途徑，或縝密嚴(yán)謹(jǐn)，或馬虎了事。

有了好的菌種來源，還要有好的工藝和方法才能持續(xù)地把好的優(yōu)勢(shì)保持下來，減少菌種退化。其中，生產(chǎn)工藝條件對(duì)微生態(tài)制劑發(fā)揮功效具有很大影響，目前常用的發(fā)酵技術(shù)，主要包括液體深層發(fā)酵和固體發(fā)酵。比較而言，液體深層發(fā)酵技術(shù)在菌體生長速度、菌種污染率、生產(chǎn)周期和無季節(jié)影響方面占據(jù)優(yōu)勢(shì)，是很多企業(yè)發(fā)展的方向。

2 科學(xué)的質(zhì)量控制

針對(duì)上述益生菌質(zhì)量控制的主要問題，需要從以下幾個(gè)方面進(jìn)行控制。

2.1 從菌種的選擇上保證其有效性

克洛生(ClOSTAT)產(chǎn)品在活性成分的篩選上是嚴(yán)格的：產(chǎn)品所含有的活性成分是從健康動(dòng)物腸道中分離出來的，獲得美國專利的枯草芽胞桿菌PB6菌株的孢子；能分泌細(xì)菌素有效抑制病原菌，如產(chǎn)氣莢膜梭菌、大腸桿菌、沙門氏菌。不僅如此克洛生?PB6活性菌株也已經(jīng)通過了EFSA（歐洲食品安全局）的審核及食品鏈與動(dòng)物健康常務(wù)委員會(huì)的審核，現(xiàn)已大量使用在歐洲畜禽養(yǎng)殖中。

CLOSTATTM系列產(chǎn)品與其他產(chǎn)品在相同條件下抑菌面積對(duì)比數(shù)據(jù)見表2。

表2 CLOSTATTM與其他產(chǎn)品在相同條件下抑菌效果對(duì)比

2.2 在生產(chǎn)工藝上嚴(yán)格把關(guān)

在發(fā)酵工藝選擇上，為確保每一批的枯草芽孢桿菌PB6都是在嚴(yán)格的控制下進(jìn)行生產(chǎn)，選擇性地利用先進(jìn)的液體發(fā)酵技術(shù)，并通過嚴(yán)格的質(zhì)量控制手段，在生產(chǎn)過程中核實(shí)每一批產(chǎn)品的枯草芽孢桿菌孢子數(shù)。在每批克洛生(CLOSTAT)產(chǎn)品生產(chǎn)之后，又非常嚴(yán)格地控制成品的枯草芽孢桿菌孢子數(shù)，通過以上的層層把關(guān)，保證克洛生(CLOSTAT)產(chǎn)品能夠持續(xù)的提供并符合理想健康腸道的要求。

2.3 質(zhì)量控制中嚴(yán)格區(qū)分芽孢和營養(yǎng)體

在關(guān)鍵的步驟中，將待測(cè)產(chǎn)品放入水浴加熱10 min，殺滅成熟菌體的同時(shí)保證芽孢不會(huì)失活，同時(shí)通過優(yōu)化方法有效地分離即將粘連生長的多個(gè)細(xì)胞，嚴(yán)格區(qū)分芽孢和營養(yǎng)體，使檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確。保證用戶添加到飼料中的孢子含量穩(wěn)定一致。

2.4 用ERP系統(tǒng)保證可追溯性

在產(chǎn)品制造方面，擁有完善的質(zhì)量保證體系，能夠沿著“供應(yīng)商原料采購，工廠生產(chǎn)控制，最終成品運(yùn)輸”這一整條線路進(jìn)行監(jiān)控和雙向追溯。具體地說是這樣的：公司使用在生產(chǎn)中所有原材料，都要按照檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行理化指標(biāo)、微生物指標(biāo)和感官分析等多重檢測(cè)，合格后才可以用于生產(chǎn)；每批產(chǎn)品生產(chǎn)時(shí)，均被ERP系統(tǒng)自動(dòng)分配特定的質(zhì)量控制批號(hào)，這樣我們可以通過此批號(hào)追溯原料使用、產(chǎn)品制造的數(shù)據(jù)，為以后的指定追蹤提供證據(jù)；在產(chǎn)品生產(chǎn)的各個(gè)階段，我們的質(zhì)檢人員也會(huì)按照檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行監(jiān)控取樣，確保產(chǎn)品品質(zhì)；產(chǎn)品在最后進(jìn)入包裝工序后，質(zhì)檢人員會(huì)再次按照抽樣要求抽取成品樣品，確保成品符合嚴(yán)格的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和要求。

3 良好質(zhì)量控制下的益生菌在腸道中的表現(xiàn)

經(jīng)過科學(xué)質(zhì)量體系控制下的益生菌，能夠充分發(fā)揮其在腸道中的功能，取得較好的生產(chǎn)效益。

枯草芽孢桿菌作為益生菌成員之一，由于其特殊的生化特性被廣泛地應(yīng)用在飼料生產(chǎn)、水處理和各類養(yǎng)殖業(yè)中；由于其好氧、可產(chǎn)芽孢、耐酸堿、耐高溫和擠壓，被廣大飼料工作者作為營養(yǎng)調(diào)節(jié)劑，普遍地使用在各類飼料生產(chǎn)中。

作為營養(yǎng)調(diào)節(jié)劑加入的枯草芽孢桿菌以芽孢的形式存在，在動(dòng)物的胃腸道中比較穩(wěn)定，特別是在酸性環(huán)境中具有高度的穩(wěn)定性。當(dāng)他們進(jìn)入腸道后迅速生長繁殖消耗環(huán)境中的游離氧，造成低氧的環(huán)境，促進(jìn)腸道有益厭氧菌生長，產(chǎn)生乳酸等有機(jī)酸降低腸道pH值，從而間接抑制其它致病菌生長。還有一類枯草芽孢桿菌能分泌細(xì)菌素直接殺滅病原菌，達(dá)到減少抗生素使用的目的，保證腸道健康的效果，即功能性益生菌。比如克洛生TM可以分泌表面素A和表面素B，對(duì)梭菌的抑制效果與恩拉霉素相當(dāng)，同時(shí)可以抑制大腸桿菌、沙門氏菌、空腸彎曲桿菌的致病菌。但是想要達(dá)到保護(hù)腸道健康，控制有害病菌的效果，光有好的菌株還不行，益生菌產(chǎn)品的品質(zhì)是關(guān)鍵，且受到多個(gè)因素的影響。

4 小結(jié)

由于生產(chǎn)工藝、質(zhì)量控制、以及菌株特性的不同，使枯草芽孢桿菌類產(chǎn)品質(zhì)量差異很大。對(duì)于使用者來說在選擇枯草芽孢桿菌類產(chǎn)品時(shí)，務(wù)必進(jìn)行多方面對(duì)比，了解產(chǎn)品標(biāo)簽中的有效信息，并結(jié)合工廠的實(shí)際情況進(jìn)行選擇。必要的時(shí)候進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)，挑選檢測(cè)結(jié)果與標(biāo)識(shí)或說明書一致的產(chǎn)品，尤其是在抑菌能力方面。只有好的能抑制病原微生物的微生態(tài)制劑才能保證飼料產(chǎn)品品質(zhì)出眾，保證腸道健康，提高畜禽生產(chǎn)性能。