■樊 振 買爾哈巴·艾合買提 美合熱阿依·木臺力甫 烏斯?jié)M·依米提

（新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830046）

在青貯飼料的生產(chǎn)中，乳酸菌起到了舉足輕重的作用，它能在發(fā)酵過程中迅速繁殖并產(chǎn)生大量的乳酸和乙酸，進(jìn)而迅速降低青貯環(huán)境的pH值，并結(jié)合周圍的無氧條件抑制了霉菌、酵母菌等有害菌的活動，從而達(dá)到保持飼料營養(yǎng)品質(zhì)和長期存貯的目的[1]。

然而，在實際生產(chǎn)中由于受路途遙遠(yuǎn)、試驗條件差等客觀因素的制約，乳酸菌青貯添加劑粉劑化顯得尤為必要。在諸多菌粉制作技術(shù)中，真空冷凍干燥法生產(chǎn)的發(fā)酵劑由于含活菌數(shù)高、發(fā)酵活力強、遺傳性穩(wěn)定、便于儲藏、攜帶方便、使用安全等優(yōu)點而被廣泛使用[2-3]。而關(guān)于乳酸菌凍干的報道，在食品方面較多，但在飼料上卻鮮有提及。

要制作優(yōu)良的凍干發(fā)酵劑，其中涉及兩個關(guān)鍵：即增加菌液的濃縮程度和減少干燥致死的數(shù)量[4]。在制作凍干粉劑的過程中，菌體細(xì)胞的分離技術(shù)是一個重要的中間環(huán)節(jié)。離心分離時，由于離心力機(jī)械作用和離心時間的影響，如果離心條件掌握不當(dāng)，菌體死亡率和損失率會隨之增高，故而選用合適的離心條件是非常必要的[5]。凍干是一個多步驟過程，會產(chǎn)生多種應(yīng)力，如低溫應(yīng)力、凍結(jié)應(yīng)力和干燥應(yīng)力等，會使細(xì)菌變性。然而凍干保護(hù)劑可以改變樣品在冷凍干燥時的物理、化學(xué)環(huán)境，減輕或防止干燥和復(fù)水對細(xì)胞的損傷，盡可能保持原有的各種生理生化特性和生物活性[6]。

本文所選用菌株均為從吐魯番地區(qū)玉米青貯飼料上分離得到。選用的保護(hù)劑為大分子保護(hù)劑、小分子保護(hù)劑和抗氧化物搭配使用，以期能得出保護(hù)效果最佳的保護(hù)劑配方。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與設(shè)備

MRS培養(yǎng)基：用于以上菌株的增殖培養(yǎng)。

抗壞血酸、海藻糖、甘油均為分析純，脫脂乳為市售脫脂奶粉。

儀器設(shè)備：真空冷凍干燥機(jī)、高速離心機(jī)。

1.2 試驗設(shè)計

1.2.1 試驗流程

單個菌落→活化→初次擴(kuò)培→二次擴(kuò)培→離心收集菌體→加入保護(hù)劑→活菌計數(shù)(cfu/ml)→分裝預(yù)凍(-20℃，12 h)→冷凍干燥→復(fù)水處理(10%脫脂乳，2 h)→計活菌數(shù)(cfu/ml）→計算凍干存活率。

1.2.2 菌體的收集和細(xì)胞懸浮液的制備

離心條件的選擇：為了使樣品凍干時有足夠的菌體，分別選擇不同的轉(zhuǎn)速和時間進(jìn)行離心，然后通過測活菌數(shù)來確定收集高濃度菌體所需要的離心條件。

懸浮液制備：用以上方法得出的最佳離心條件將菌液離心后去上清液，然后將不同保護(hù)劑分別加入菌體沉淀中，懸浮液制備好后測活菌數(shù)。

軟件開發(fā)過程實現(xiàn)開放化管理，也就是實現(xiàn)對資源的共享，通過公開軟件源代碼，使得軟件產(chǎn)品的標(biāo)準(zhǔn)化工作逐步被推動起來，軟件的兼容性問題能夠進(jìn)一步提高，進(jìn)而能夠達(dá)到對資源共享的目的。同時，軟件開發(fā)設(shè)計人員在未來可以實現(xiàn)彼此之間的相互交流，實現(xiàn)共同進(jìn)步，也可以彼此之間通力合作，實現(xiàn)計算機(jī)軟件行業(yè)的不斷可持續(xù)發(fā)展。

1.2.3 冷凍干燥存活率的測定

活菌數(shù)測定：吸取0.5 ml待測菌液用滅菌的生理鹽水進(jìn)行10倍梯度稀釋，選擇適當(dāng)?shù)南♂屘荻?，吸?00 μl菌懸液置于平板內(nèi)，加入15 ml左右的MRS培養(yǎng)基混勻，每個稀釋梯度3個平行。平板在37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后，選擇菌落數(shù)在30～300之間的平板進(jìn)行計數(shù)。

存活率計算公式[7]：

2 結(jié)果與討論

2.1 離心法收集菌體細(xì)胞

本試驗用不同的離心力和不同的離心時間，篩選出了兩株菌分別要獲得最大活菌數(shù)所需的離心條件，試驗結(jié)果如圖1和圖2所示。

圖1 離心條件對植物乳桿菌離心效果的影響

圖2 離心條件對腸膜狀明串株葡聚糖亞種離心效果的影響

通過比較離心條件對兩株菌離心效果的影響，可以得出兩株菌均在5 000 r/min的條件下離心10 min，所得的活菌數(shù)最高。L.P（植物乳桿菌）活菌數(shù)可達(dá)1.14×1012cfu/g，而L.D(腸膜狀明串株葡聚糖亞種)活菌數(shù)可達(dá)7.2×1011cfu/g。

在離心分離過程中，一方面，部分菌體殘留于上清液中造成損失；另一方面，由于離心力的作用造成的機(jī)械損傷會使部分菌體死亡。如果離心工藝掌握不當(dāng)，必然導(dǎo)致發(fā)酵劑中活菌含量的下降。田洪濤（1998）在離心雙歧桿菌時發(fā)現(xiàn)，在采用“低速長時”或“高速短時”離心時，離心損失率明顯下降，收獲的活菌數(shù)最多[8]。本試驗所得結(jié)果與其得出的結(jié)論基本一致。

2.2 正交試驗優(yōu)化凍干保護(hù)劑

本試驗采用4因素3個水平的正交試驗L9(34)來確定4種保護(hù)劑：海藻糖、脫脂奶粉、抗壞血酸和甘油的復(fù)合配方，正交試驗的因素水平設(shè)計見表1，試驗結(jié)果見表2和表3。如表2和表3所示，4種保護(hù)劑在單因素試驗中都有很好的保護(hù)效果。

表1 正交試驗因素水平設(shè)計

表2 植物乳桿菌凍干保護(hù)劑的篩選

表3 腸膜狀明串株葡聚糖亞種凍干保護(hù)劑的篩選

由表2的試驗結(jié)果可以看出，影響植物乳桿菌凍干存活率的因素從大到小為A＞B＞D＞C,脫脂乳的效果最為明顯，甘油效果較差。通過優(yōu)化凍干保護(hù)劑的正交試驗結(jié)果，可以得到植物乳桿菌的最佳保護(hù)劑配方為：脫脂乳15%、海藻糖6%、甘油2%，抗壞血酸3%（以上均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。植物乳桿菌在使用此保護(hù)劑的情況下凍干存活率可達(dá)到88.21%。

由表3的試驗結(jié)果可以看出，影響腸膜狀明串株葡聚糖亞種凍干存活率的因素從大到小為A＞B＞D＞C,其中脫脂乳的效果最為明顯，甘油效果較差。通過優(yōu)化凍干保護(hù)劑的正交試驗結(jié)果，可以得到腸膜狀明串株葡聚糖亞種的最佳保護(hù)劑配方為：脫脂乳15%、海藻糖6%、甘油1%、抗壞血酸2%（以上均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。腸膜狀明串株葡聚糖亞種在使用此保護(hù)劑的情況下凍干存活率可達(dá)到90.02%。

保護(hù)劑可以減少冷凍干燥引起的微生物細(xì)胞的損傷。配制保護(hù)劑時應(yīng)當(dāng)注意保護(hù)劑材料的搭配[9]。一般來說，保護(hù)劑大體上可以分為兩類：一類為小分子化合物，如氨基酸、醇類和糖類等；另一類為大分子物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、可溶性淀粉等。原則上小分子保護(hù)劑搭配大分子保護(hù)劑就能獲得良好的保護(hù)效果。

脫脂乳作為最常見的一種保護(hù)劑，其多種成分可以在凍干過程中起保護(hù)作用，如其中的乳清蛋白能夠在菌體外形成蛋白膜，對細(xì)胞加以保護(hù)，并可以固定凍干的酶類，防止由于細(xì)胞壁蛋白質(zhì)的損壞而引起的胞內(nèi)物質(zhì)泄漏[10]。在本試驗中，脫脂乳在兩株菌的凍干過程中起的作用也最為明顯。近年來，海藻糖的保護(hù)作用日益被人們所重視，關(guān)于海藻糖對生物分子的保護(hù)作用，大致有兩種假說，一是“玻璃態(tài)”假說，該假說認(rèn)為通過海藻糖玻璃化轉(zhuǎn)變的趨勢，使細(xì)菌在冷凍干燥過程中和復(fù)水過程中均處于液晶狀態(tài)，在這種結(jié)構(gòu)中，分子運動和分子反應(yīng)非常微弱[11]。二是“水替代”假說，該假說認(rèn)為當(dāng)生物大分子失去包圍在其表層以維持其結(jié)構(gòu)和功能的水膜時，海藻糖能在失水部位以氫鍵形式連接，形成一層保護(hù)膜以代替失去的結(jié)構(gòu)水膜，來維持生物大分子的空間結(jié)構(gòu)[12]。而甘油作為一種小分子保護(hù)劑，凍干時在胞內(nèi)起如下作用：一是改變了胞內(nèi)的過冷狀態(tài)，使胞內(nèi)外壓力接近，降低了細(xì)胞脫水縮皺程度和速度；二是小分子保護(hù)劑能順利進(jìn)出細(xì)胞，緩解了因復(fù)水引起的滲透性腫脹而帶來的損傷?？箟难嶙鳛橐环N抗氧化劑，能降低保護(hù)劑的氧化還原電位，并消耗試驗過程中的部分氧氣，防止對菌體有害的胺基羥基反應(yīng)或氧化作用，保持了細(xì)胞活性并提高穩(wěn)定性。

3 結(jié)論

通過優(yōu)化凍干保護(hù)劑的正交試驗結(jié)果，可以確定植物乳桿菌的最佳保護(hù)劑配方為：脫脂乳15%、海藻糖6%、甘油2%、抗壞血酸3%，此時植物乳桿菌的凍干存活率可達(dá)到88.21%。腸膜狀明串株葡聚糖亞種的最佳保護(hù)劑配方為：脫脂乳15%、海藻糖6%、甘油1%、抗壞血酸2%，此時腸膜狀明串株葡聚糖亞種的凍干存活率可達(dá)到90.02%。

本試驗所選用的4種保護(hù)劑具有較好的互補作用，脫脂乳主要在細(xì)胞表面起保護(hù)作用；甘油能滲透到細(xì)胞內(nèi)部；海藻糖在干燥過程中形成一種玻璃態(tài)，由于極高的黏度使得分子擴(kuò)散系數(shù)很低，降低了細(xì)胞壁的通透性；最后結(jié)合抗氧化性能良好的抗壞血酸，使得乳酸菌在凍干后存活率大大提高，從而克服了如路途遙遠(yuǎn)、活菌數(shù)不足、飼養(yǎng)地區(qū)試驗條件差等因素的制約，為青貯飼料添加劑在農(nóng)牧區(qū)的推廣提供了現(xiàn)實依據(jù)。