■周孟清 謝申伍 呂治鋼 郭超林 賈 峰 殷海成

(1.河南工業(yè)大學生物工程學院，河南鄭州 450001；2.云南東恒集團生物飼料公司，云南富源 655500)

核桃(Walnut)又稱胡桃、姜桃，屬胡桃科胡桃屬植物，性溫味甘無毒,有健胃、補血、補腎固精、溫肺定喘、解毒消腫、殺蟲止癢、潤腸等功效，《本草綱目》和《中國木本藥用植物》記載，核桃的仁、葉、枝、青皮、樹皮都具有很高的藥用價值。薄皮核桃是近幾年開發(fā)種植的新品種，具有獨特的優(yōu)點，產量高，果殼薄，內隔膜退化，取仁容易，并且營養(yǎng)價值高。

核桃殼的主要成分為纖維素、木質素和半纖維素等碳水化合物（鄭志鋒,2006)，還含有核桃醌、氫化胡桃醌、鞣質、β-葡萄糖甙、沒食子酸等有機化合物。這些活性物質具有抗氧化（胡博路等2002)，促進機體生長，提高機體免疫力等作用。

微波輔助提取具有快速、高效、節(jié)能、環(huán)保等特點，是利用物理場強化溶劑過程的一種提取方式，它把微波作為溶劑和樣品加熱的熱源，當被提取樣品和溶劑同處于微波場時，由于微波對物質的特殊效應，使分子相互碰撞、摩擦產生熱效應，使提取體系整體性同時迅速加熱，且表里加熱均勻，細胞內組分獲得能量掙脫周邊的束縛，在非常短的時間內分子由里向外進行遷移，直至平衡，從而使這些組分從基體物質中分離出來。

國外很早就將微波技術應用于許多行業(yè)，近年來將微波提取運用于天然產物有效成份提取的研究日益增多，而將微波輔助提取用于核桃殼還未見報道。另外，抗生素長期使用導致病原菌產生抗藥性,近期發(fā)生的禽流感、豬流感都說明了這一問題的嚴重性，新型安全綠色飼料添加劑的開發(fā)得到了人們的關注和重視，云南和新疆是我國著名的核桃主產區(qū)，每年有幾十萬噸核桃殼廢棄，為了將核桃殼開發(fā)成綠色飼料及食品添加劑提高動物產品質量及促進人們健康，本試驗先采用微波輔助法提取核桃醌，再檢驗其對小鼠生長性能和免疫的影響，以便于對核桃殼的應用提供科學依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

薄皮核桃殼：由河南工業(yè)大學實驗室提供，經60℃烘干5 h后粉碎，過60目篩，備用；蒸餾水；無水乙醇；普通鼠糧：購于河南省動物實驗中心。

主要儀器和設備：粉碎機GFSJ-18(新鄉(xiāng)同心機械有限公司)，分光光度計722S（上海雙旭電子有限公司），微波爐G90D23CSJ-Q2（廣州格蘭仕有限公司），恒溫水浴鍋HH-4（鄭州教學儀器廠），F(xiàn)A1204B電子天平（上海精密科學儀器有限公司）；小鼠飼養(yǎng)籠，實驗室提供；醫(yī)用剪刀；止血鉗。

1.2 試驗方法

核桃醌標準曲線如圖1所示，按照均勻試驗設計表U6（6）4，并采用微波輔助提取法，提取各組分核桃殼中的核桃醌，最后用722S分光光度計分別測量各組分的吸光度。

圖1 核桃醌的標準曲線

工藝流程:核桃殼干燥→粉碎→準確稱取100 g→按照均勻試驗設計表，每次取樣量為5.000 0 g左右，加無水乙醇溶解，微波輔助提取，研究4個因素提取時間、料液比、微波功率、核桃殼粒徑對提取核桃琨的影響→布氏漏斗過濾→取濾液用分光光度計測量吸光值，根據(jù)標準曲線計算出提取的核桃醌量。

另外，布氏漏斗過濾→取濾液于500 ml燒瓶中→恒溫水浴鍋60℃恒溫加熱→加熱4～5 h待燒杯中沒有乙醇揮發(fā)→得到提取的核桃醌，用于小鼠生長試驗的材料。

1.3 試驗動物

試驗動物為6周齡昆明系小白鼠，由河南省實驗動物中心提供。

表1 微波輔助提取核桃醌的均勻設計

試驗采用單因素設計，將24只無體重差異雄性小鼠隨機分為4組，即：普通飲水對照組O、試驗組A、試驗組B、試驗組C，每組6只共一鼠籠。核桃殼添加量分別相當于飼料采食量的0%、0.32%、0.64%、0.93%，將核桃殼醌加入到小鼠的飲水中。每個鼠籠配備采食料槽和飲水器，加入墊料，提供充足的普通小鼠日糧，小鼠自由采食、自由飲水。保持飼養(yǎng)溫度適宜，控制在15～25℃之間，環(huán)境適應飼養(yǎng)3 d，正式期飼養(yǎng)14 d，每天進行觀察，注意補加飼料，記錄試驗數(shù)據(jù)。

1.4 生長性能測定

試驗開始時稱量小鼠的體重和加入的飼料質量，第15 d斷食斷水半天后稱量體重和剩余的飼料質量，計算出小鼠的平均日采食量、日增重等指標。后將其脫臼處死，解剖取出胸腺和脾臟，進行稱重，計算出胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)。小鼠胸腺或脾臟指數(shù)=胸腺或脾臟重量(mg)/體重(g)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

應用分析軟件SPSS 18對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。不同處理的樣品數(shù)據(jù)顯著性差異采用單因子方差分析(AVOVA，LSD檢驗)進行檢驗，數(shù)據(jù)結果以“平均值±標準差(X±SD)”表示。

2 結果與分析

2.1 微波輔助法提取核桃殼中核桃醌試驗結果

由SPSS18.0回歸分析得：y1=1.053-14.788x1-0.002x2-0.001x3+0.032x4（1）

其中，y1為吸光值；x1為料液比；x2為功率；x3為時間；x4為粒徑。

核桃醌標準曲線方程為y=151.05x+1.139 2 (2)

其中：x吸光度；y為核桃醌含量(mg)。由本試驗結果可得核桃醌的最佳微波輔助法提取條件為：時間35 s，料液比1∶5，微波功率480 W，核桃殼粒徑80#。從而計算提取核桃醌的吸光值為0.582，計算可得核桃醌含量為89.05 mg，提取率為1.779%。據(jù)報道，2012年中國核桃總產量達到120萬噸，按照出殼率30%計算，其副產物核桃殼總量約36萬噸以上。若用微波輔助提取，可以得到6 408 t核桃醌，對于醫(yī)療保健方面有著重大的價值。

2.2 核桃醌類物質對小鼠生長性能的影響（見表3）

表2 微波輔助法提取核桃殼中核桃醌均勻設計試驗結果

表3 核桃醌類物質對小鼠生長性能的影響

由表3可知，試驗前小鼠質量和試驗后小鼠體重各組都無顯著差異。試驗組B和試驗組A的小鼠增重均較對照組O有所增加，但是差異不顯著，而試驗組C組較對照組會顯著抑制小鼠的生長（P＜0.01），表明核桃殼醌在低濃度時對小鼠生長有一定促進作用，但高濃度0.93%的核桃醌類物質會抑制小鼠的生長。核桃醌類物質對小鼠總采食量和平均日采食量影響差異不顯著，但隨著核桃醌類物質添加量增多有升高的趨勢。

2.3 核桃醌類物質對小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的的影響

小鼠飼養(yǎng)第15 d斷食斷水半天后將小鼠脫臼處死后，稱量體重、胸腺質量、脾臟質量，結果見表4。

表4 核桃醌類物質對小鼠免疫器官指數(shù)系統(tǒng)的影響

表4結果顯示，試驗組C、試驗組B和試驗組A中的胸腺指數(shù)均比對照組高，且呈現(xiàn)隨濃度升高有增加的趨勢，但都沒有表現(xiàn)出顯著差異。試驗組C、試驗組B和試驗組A中的脾臟指數(shù)與對照組O比較，均較對照組高，試驗組C和試驗組B與對照組O差異不顯著，而試驗組A中的脾臟指數(shù)與對照組O差異極顯著（P＜0.01）。表明核核桃醌類物質在低濃度時對小鼠的脾臟免疫能力有較大的影響，具體影響機理有待進一步探索研究。核桃醌類物質對小鼠胸腺質量和胸腺指數(shù)影響差異不顯著，但隨著核桃醌類的增多有升高的趨勢。

3 討論

3.1 不同提取方法對薄皮核桃殼中核桃醌提取率的影響。

胡桃科(Juglandaceae)是胡桃目植物僅有的一科，該科藥用植物全世界有9屬約71種,絕大多數(shù)種分布在北溫帶和亞洲熱帶地區(qū)，我國有7屬27種1變種,南北均產。胡桃科植物為落葉、半常綠或常綠喬木,其枝、葉（Eidi等,2013a)、外果皮、花（Ebrahimzadeh等,2013)、根皮、樹皮（Zakavi等,2013)、堅果內隔及果仁均可入藥。其中胡桃屬山核桃屬植物,歷來被人們所重視,有著較長的研究歷史。近年來研究表明該科植物具有抗腫瘤、陣痛、抑菌等作用（吳威等,2011)。

我國核桃栽培面積是世界第一位，據(jù)統(tǒng)計2009年核桃產量約為98萬噸，2011年為110萬噸，2012年約為120萬噸，按照核桃殼質量占核桃質量30%計算，年核桃殼產量為30多萬噸遭丟棄或焚燒，造成了資源的極大浪費。

本試驗按照均勻設計表采用微波輔助提取法薄皮核桃殼中醌類物質，得率達到1.78%，其他方法如：采用5種大孔吸附樹脂提取核桃殼總黃酮（宋倩等,2012)，超聲波提取山核桃殼色素（孫海濤等,2012)，響應面法對核桃殼總黃酮的提取工藝進行優(yōu)化（呂昌勇等,2013)，都有不同的產物得率，這是由提取方法和參數(shù)不同所致。

3.2 核桃醌類物質對小鼠生長性能和免疫的影響

本試驗結果表明，核桃醌能夠在一定程度上提高小鼠的增重和脾臟免疫能力，可能與核桃醌具有抗出血功能，核桃醌衍生物有抗菌活性有關；但是胸腺免疫差異不顯著，原因可能是由于采用的溶劑和提取方法不一樣所得產物不一樣（盧四平等,2012)，另外本試驗中得到的是核桃醌及其類似物，所以對動物的作用不一樣。他人研究發(fā)現(xiàn)，核桃殼不同提取物對綠膿桿菌、痢疾桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、變形桿菌、大腸桿菌、傷寒桿菌、白色念珠菌有一定的抑制或殺滅作用（張海珠等,2012)，可以治療血崩、乳癰、疥癬、瘡瘍和消腫止癢，而高溫高壓滅菌的核桃殼對銅綠微囊藻生長的抑制效果較明顯（齊健等,2011)，這與核桃殼中含有一定活性內源抑制物質,對小麥、黃瓜種子萌發(fā)和幼苗生長有明顯的抑制作用相一致（賈彩霞等,2006),另外，核桃殼碳化后對細菌、病毒具有較強吸附、固定、抑制排出能力，可以治療嚴重腹瀉（羅洪,2011)。

3.3 核桃殼作為飼料和食品添加劑的綜合利用開發(fā)

在綜合利用方面，核桃殼可被用來制備食用棕色素（孫海濤等,2012)、木糖、活性炭（劉巍等,2012)即碳分子篩（楊娟等，2012)。核桃殼粉可以吸附水溶液中 Pb2+、Hg2+、Mn2+、Cr3+、Cu2+（Zare等,2012；許振等,2012；Zabihi等,2010；于春光等,2012；張鳳君等,2012；魯秀國等，2012)，可以吸附水體中孔雀石綠和4-氯苯酚（張曼曼,2012)，改性核桃殼處理制革廢水中的氨氮（屈振宇等，2011)，還可以用于鎘、鉛污染土壤的修復（褚興飛,2011)，水液中的銫（Ding等,2013)及餐飲廢水過濾吸附（張鳳娥等,2012)。在油氣田污水處理中也用到核桃殼過濾器（金彥雄,2012)，可以處理油田含油污水（王立國等,2006)。

核桃殼中鞣質也稱單寧是一類多元酚類化合物，能凝固微生物體內的原生質，抑制多種酶的作用，因此對多種細菌、真菌、酵母都有明顯的抑制能力，其進入機體內部后不影響動物體細胞正常生長。鞣質抗氧化功效與同濃度的茶多酚功能接近，能有效地清除羥基自由基，而對氧基自由基基本無清除作用，可抑制脂質過氧化而保護肝腎等器官，抗氧化作用與抗癌作用相關，從山核桃殼75%乙醇提取物乙酸乙酯萃取物中分離得到了17種單體化合物，其中4種化合物表現(xiàn)出較強的抑制人腫瘤細胞增殖作用（吳威等,2012)。單寧與烏洛托品復配后可以提高緩蝕率（劉建平等,2012)。核桃仁中多酚可以用于治療香煙毒物所導致的小鼠急性炎癥、氧化應激和肺部損傷（Qamar等，2011)。

核桃殼中沒食子酸為白色或淺褐色針狀結晶或粉末狀物質，有抗菌抗病毒和抗腫瘤作用，在中醫(yī)治療中可用于隔核桃灸法治療白內障和周圍面神經麻痹（段方勝,1996)。核桃殼中還含有多糖如：泡核桃殼多糖由D-甘露糖、鼠李糖、半乳糖、D-半乳糖醛酸、葡萄糖、D-葡萄糖醛酸、D-阿拉伯糖等11種單糖(有4種未鑒定出的單糖)組成，D-阿拉伯糖的相對平均含有量最高（張海珠等,2012)。核桃仁是具有很高經濟利益的堅果，以其營養(yǎng)、健康、感官特性在全球很受歡迎和重視，其營養(yǎng)豐富，富含不飽和脂肪酸、褪黑激素、生育酚和抗氧化劑等，對于人類的心臟病、癌癥、動脈疾病、糖尿病（Mohammadi等,2012)、高血壓、老年癡呆（Carey等,2013)、肥胖癥和臨床抑郁癥的發(fā)生都有減緩和預防作用。

核桃樹葉已廣泛用于民間治療皮膚炎癥（Leise等,2012)，多汗癥和潰瘍，用于抗腹瀉，驅蟲，防腐，收斂劑等，還可以用于CCl4誘導的鼠肝臟中毒的修復（Eidi等,2013b)。核桃青皮，又稱青龍衣，含有沒食子酸、核桃醌、鞣質等有效成分，具有抗自由基和抗氧化能力潛力，可作為抗菌和抗氧化的天然化合物資源，相關研究也已證實核桃青皮提取物對提高小鼠的免疫力有顯著的效果。

4 結論

以核桃殼為主要原料，無水乙醇作溶劑，采用微波輔助提取核桃醌類物質，最佳微波輔助提取條件為：時間35 s，料液比1∶5，微波功率480 W，核桃殼粒徑80#，提取率為1.779%。小鼠生長和免疫初步試驗表明低濃度0.32%核桃醌類，對小鼠的體重的增長有一定程度的促進作用，可以提高機體的免疫功能，本試驗結果對核桃殼綠色添加劑的開發(fā)展具有借鑒意義。

（參考文獻40篇，刊略，需者可函索）