徐雅琴，李 靜，于澤源，楊 昱，于子淇

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，哈爾濱 150030）

黑穗醋栗(Ribes nigrum L.)，俗名黑加侖、黑豆果，是一種適宜于逆溫帶生長的多年生小灌木，屬于虎耳草科。其果實有很高的營養(yǎng)價值，富含黃酮、活性多糖、維生素、氨基酸、礦物質(zhì)等多種營養(yǎng)成分[1]。其中的黃酮類化合物是黑穗醋栗果實中有效功能性成分之一，據(jù)相關(guān)研究表明，黃酮類化合物具有抗氧化、抗癌癥、抗糖基化、抗炎癥等生理活性，同時在醫(yī)藥、化妝、保健、食品加工方面有廣泛用途[2]。近幾年研究表明，蛋白質(zhì)與羰基化合物發(fā)生非酶糖基化反應(yīng)，形成的糖基化終產(chǎn)物（AGEs），與糖尿病、衰老、老年性癡呆癥、動脈粥樣硬化的發(fā)生密切相關(guān)[3]。

本文對黑穗醋栗黃酮的抗氧化性以及非酶糖基化反應(yīng)中Amodori產(chǎn)物形成階段、二羰基化合物形成階段和終產(chǎn)物AGEs形成階段的抑制作用分別進行研究，為黑穗醋栗的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

黑穗醋栗（布勞德）（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝實驗站）；牛血清蛋白（哈爾濱華美生物工程公司）；1,1-二苯基苦基苯肼（DPPH）（Sigma公司）；氯化硝基四氮唑藍（NBT)及其他試劑均為分析純。

1.1.2 儀器

T6新悅-可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司），TU-1901雙光束紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司），JY92-2D超聲波細胞粉碎機（寧波新芒生物科技），隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海市躍進醫(yī)療器械一廠），熒光/磷光發(fā)光光度計LS45（美國PerkinElmer）。

1.2 方法

1.2.1 總黃酮的制備

稱取10 g黑穗醋栗果漿，按液料比1:12加入95%乙醇，在功率500 W下超聲提取3次，每次30 min。過濾，將3次濾液混合，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，用乙酸乙酯萃取黃酮類物質(zhì)，減壓濃縮除去乙酸乙酯，用95%乙醇溶解，多次提取富集，冷凍備用。

1.2.2 總黃酮的含量測定[4]

以蘆丁為對照品，按照紫外分光光度法繪制蘆丁標準曲線，在266 nm處測定提取物中總黃酮含量。蘆丁濃度c在0～1.00 mg·mL-1范圍內(nèi)與吸光度（A）具有良好的線性關(guān)系，回歸方程為：A=17.661c+0.0046，R2=0.9996。

1.2.3 羥自由基(·OH)清除能力的測定

參照Fenton反應(yīng)建立反應(yīng)體系模型[5]，向試管中加 2.00 mL 8 mmol·L-1FeSO4，2.00 mL 8 mmol·L-1水楊酸-乙醇，2.00 mL濃度為0.20、0.40、0.60、0.80和1.00 mg·mL-1的黃酮提取液，最后加2.00 mL 8.8 mmol·L-1H2O2啟動反應(yīng)，37 ℃反應(yīng)30 min，在510 nm下測定各反應(yīng)溶液的吸光度A1。以2.00 mL蒸餾水代替2.00 mL H2O2溶液作空白調(diào)零，以2.00 mL蒸餾水代替黃酮溶液測吸光值A(chǔ)0。以2.00 mL 8 mmol·L-1FeSO4，2.00 mL 8 mmol·L-1水楊酸-乙醇，2.00 mL不同濃度黃酮提取液和2.00 mL蒸餾水作為黃酮的本底值A(chǔ)2，計算清除率，VC做陽性對照。所有試驗均3次重復(fù)，結(jié)果采用平均值±標準偏差表示，采用SPSS軟件進行差異顯著性分析。

1.2.4 超氧陰離子自由基清除能力的測定

采用鄰苯三酚自氧化法[6]，取50 mmol·L-1Tris-HCl緩沖溶液（pH 8.2）5 mL，加入4.7 mL H2O，混勻后25℃水浴保溫20 min。然后加入3 mmol·L-1鄰苯三酚0.3 mL，立即于319 nm處每隔30 s記錄一次吸光度(A0)，持續(xù)10 min，計算線性范圍內(nèi)每分鐘吸光度的增加值(V0)。再依上法試驗，在加入鄰苯三酚前加入濃度分別為0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mg·mL-1的黑穗醋栗總黃酮溶液2.0 mL，混勻25℃水浴保溫20 min，取出后立即加入25℃預(yù)熱過的3 mmol·L-1的鄰苯三酚0.3 mL，混勻，于319 nm處每隔30 s記錄1次吸光度(At)，持續(xù)10 min。計算線形范圍內(nèi)每分鐘吸光度的增加值(Vt)。以VC作陽性對照，按照下面公式計算黑穗醋栗總黃酮對O2-·的清除率。

1.2.5 DPPH自由基清除能力的測定[7-8]

取濃度分別為 0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60 mg·mL-1的黑穗醋栗黃酮溶液2.00 mL于試管中，加入0.3 mmol·L-1DPPH 2.00 mL，避光反應(yīng)30 min，于517 nm波長處測定吸光度(Ai)；再取上述黃酮溶液2 mL，加入2.00mL無水乙醇，反應(yīng)30 min測吸光度(Aj)；取2.00 mL DPPH，加入2.00 mL無水乙醇，反應(yīng)30 min測吸光度(A0)。以Vc做陽性對照，按照下面公式計算黑穗醋栗總黃酮對DPPH自由基清除率。

1.2.6 糖基化活性研究

1.2.6.1 體外非酶糖基化體系的建立[9]

在無菌條件下，向無菌細胞培養(yǎng)瓶中加入用0.2 μm除菌膜除菌后的20.00 g·L-1牛血清白蛋白溶液和0.50 mol·L-1葡萄糖溶液各5.00 mL，加入含1%NaN3的0.20 mol·L-1pH 7.4的磷酸鹽緩沖液10.00 mL，建立完整糖基化體系對照組a，同時設(shè)立不加黃酮溶液不加葡萄糖溶液的對照組b；加黃酮溶液不含蛋白的對照組c；加黃酮溶液不加葡萄糖溶液的對照組d。設(shè)置溶液中黃酮終濃度分別為0.05 、0.10、0.15、0.20 mg·mL-1的干預(yù)組，37 ℃恒溫培養(yǎng) 14 d。分別于 0、2、4、6、8、10、12、14 d進行試驗。

1.2.6.2 NBT還原實驗

取0.50 mL糖基化物質(zhì)和2.00 mL 0.3 mmol·L-1NBT在2.50 mL 100 mmol·L-1pH 10.35碳酸鈉緩沖溶液中，至于室溫孵化20 min，在最大吸收波長412 nm處測定吸光度。用碳酸鈉緩沖溶液代替糖基化物質(zhì)作為空白，按公式(2-1)計算抑制率IE。公式(2-1)：

1.2.6.3 二羰基化合物含量測定[10]

取糖基化體系溶液0.40 mL與0.20 mL 500 mmol·L-1吉拉德-T儲備液和3.40 mL pH 2.9甲酸鈉溶液在室溫下孵化1 h，在最大吸收波長277 nm處測定吸光度，以甲酸鈉溶液代替糖基化物質(zhì)為空白。以乙二醛標準曲線計算二羰基化合物含量，按公式(2-1)計算抑制率IE。

1.2.6.4 糖基化終產(chǎn)物熒光強度的測定[11]

取出0.5 mL培養(yǎng)液，稀釋至10 mL，測定糖基化終產(chǎn)物在激發(fā)波長370 nm發(fā)射波長440 nm處的熒光值F，計算對非酶糖基化的抑制率IE。公式(2-2)：

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度的黃酮提取物對羥自由基的清除能力

從圖1中可以看出，黑穗醋栗總黃酮和Vc對羥自由基清除能力都隨濃度增加而逐漸增強，當濃度在0～0.7 mg·mL-1范圍內(nèi)，黃酮對羥自由基清除率大于Vc，當濃度大于0.7 mg·mL-1時，Vc對羥自由基清除率高于黃酮。黑穗醋栗黃酮的IC50=0.296 mg·mL-1，Vc的IC50=0.379 mg·mL-1。黃酮和 Vc濃度對羥自由基清除率都呈顯著性差異(P＜0.05)。

圖1 對羥自由基的清除能力Fig.1 Scavenging ability of hydroxyl radicals

2.2 不同濃度的黃酮對超氧陰離子(O2-·)自由基清除能力

從圖2可以看出，Vc對O2-·自由基清除率在0～0.2 mg·mL-1范圍內(nèi)，迅速上升至95%以上之后逐漸趨于平衡。黑穗醋栗總黃酮對O2-·自由基清除率先隨濃度增加而上升之后略有下降，當濃度為0.80 mg·mL-1時清除率達到最大81.33%，黑穗醋栗總黃酮的IC50=0.279mg·mL-1，Vc的IC50=0.0927mg·mL-1。與Vc相比黑穗醋栗總黃酮對O2-·自由基清除能力略低，但仍表現(xiàn)出很強的清除能力。黃酮濃度對其清除率差異性比Vc的差異性顯著(P＜0.05)。

圖2 對O2-·的清除能力Fig.2 Scavenging ability of superoxide anion radicals

2.3 對DPPH自由基清除能力

由圖3可以看出，隨著黑穗醋栗總黃酮濃度的增加，對DPPH自由基的清除能力逐漸增強，當濃度為0.6 mg·mL-1時清除率達到57.68%，IC50=0.319 mg·mL-1；Vc隨濃度的增加，對DPPH自由基的清除能力也略有增強，濃度為0.6 mg·mL-1時清除率達到40.15%，IC50=8.519 mg·mL-1，可見黑穗醋栗總黃酮對DPPH自由基的清除能力相對比較好。黃酮濃度在0.1，0.2，0.3mg·mL-1時，DPPH自由基的清除率顯著性差異(P＜0.05)。

圖3 對DPPH自由基清除能力Fig.3 Scavenging ability of DPPH radical

2.4 黃酮的抗非酶糖基化活性

2.4.1 對Amadori產(chǎn)物生成的影響

影響結(jié)果見圖4和表1，在糖基化反應(yīng)初期，葡萄糖的羰基與蛋白質(zhì)游離的氨基發(fā)生作用生成西弗堿，重排成Amadori產(chǎn)物。在0～8 d內(nèi)，糖基化體系中Amadori產(chǎn)物的量明顯增加，8～14 d內(nèi)變化不大逐漸趨于平衡。不同濃度的黃酮在糖基化體系中，對Amadori產(chǎn)物的產(chǎn)生都有一定抑制作用，而且隨著黃酮濃度的增加抑制作用逐漸增強。在濃度為0.2 mg·mL-1時，抑制率達到30.69%(P＜0.05)。

2.4.2 二羰基化合物含量測定

由圖5和表1可看出，在0～10 d內(nèi)二羰基化合物含量增加趨勢顯著，在10～14 d二羰基化合物的含量逐漸趨于平衡，加入不同濃度的黑穗醋栗總黃酮對糖基化體系中的二羰基化合物的產(chǎn)生都有一定的抑制作用，濃度增加，二羰基化合物生成量降低的越明顯，抑制作用越強。在濃度為0.2 mg·mL-1時，抑制率達到48.15%(P＜0.05)。

圖4 對Amadori產(chǎn)物生成的抑制作用Fig.4 Inhibitory effects of Amadori product

圖5 對二羰基化合物產(chǎn)生的抑制作用Fig.5 Inhibitory effects of dicarbonyl compounds

表1 黃酮對葡萄糖/BSA體系A(chǔ)madori產(chǎn)物、二羰基化合物及GAEs形成的抑制作用Table 1 The inhibitory effects of flavonoids on the formation of Amadori product,dicarbonyl compounds and GAEs in glucose/BSA system

2.4.3 非酶糖基化終產(chǎn)物熒光強度測定

糖基化體系在孵化過程中能夠產(chǎn)生具熒光性質(zhì)的糖基化產(chǎn)物，影響結(jié)果見圖6和表1，在完全糖基化體系中AGEs熒光強度迅速增加；加入不同濃度的黑穗醋栗總黃酮的糖基化體系中，熒光強度亦有所增長，但與完全糖基化體系相比明顯降低；在濃度為0.2 mg·mL-1時，抑制率達到42.59%(P＜0.05)。

圖6 非酶糖基化終產(chǎn)物熒光強度Fig.6 Fluorescence intensity of AGEs

3 討 論

3.1 黑穗醋栗總黃酮的抗氧化作用

黑穗醋栗總黃酮提取物具有較明顯的抗氧化作用，并隨提取濃度的增加而增強。①羥自由基的清除試驗可知，黑穗醋栗總黃酮在FeSO4-H2O2體系中具有良好的清除羥自由基能力，在測定濃度范圍內(nèi)其清除能力隨著濃度的增加而逐漸增強，濃度低于0.7 mg·mL-1時，黃酮對羥自由基清除率大于Vc，而0.7 mg·mL-1以后黃酮的自由基清除率增加變慢，且低于Vc的清除率。這可能是由于黃酮類化合物在濃度較高時，往往表現(xiàn)出抗氧化效果減弱或發(fā)生促氧化作用引起。②從清除超氧陰離子試驗可知，黃酮對超氧陰離子自由基清除率先隨濃度的增加而增強，之后略有下降趨勢，黃酮濃度為0.8 mg·mL-1時，清除率達到最大81.33%，這種現(xiàn)象也與黃酮類化合物在高濃度時抗氧化效果不明顯有關(guān)。黑穗醋栗總黃酮和Vc的IC50分別是0.279，0.0927 mg·mL-1。從 IC50值來看，Vc對清除超氧陰離子自由基能力強于黑穗醋栗黃酮。③從清除DPPH試驗可知，黑穗醋栗總黃酮對DPPH自由基也有較好清除能力，這應(yīng)該是由黃酮類化合物抗氧化所必需的基團B環(huán)鄰二酚羥基引起[15]。當濃度為0.6 mg·mL-1時，清除率達到57.68%。

3.2 黑穗醋栗總黃酮抗非酶糖基化作用

①在堿性溶液中Amadori產(chǎn)物可以還原NBT產(chǎn)生顏色變化，本文通過NBT還原試驗對其吸光度的測量，可見黑穗醋栗總黃酮對Amadori產(chǎn)物的產(chǎn)生有抑制作用，這可能因為黑穗醋栗黃酮中含有帶醛基的黃酮類化合物，醛類可以和蛋白質(zhì)的氨基酸殘基反應(yīng)形成Schiff堿，從而限制了葡萄糖和蛋白質(zhì)的氨基酸殘基的反應(yīng)。②中期,Amadori產(chǎn)物通過氧化、水解降解成一系列二羰基化合物，是糖基化終產(chǎn)物的主要來源，結(jié)果表明，隨時間變化黃酮類化合物對二羰基化合物產(chǎn)生量也有抑制作用，可能是黃酮類化合物通過與葡萄糖醛上的羰基結(jié)合，阻止糖基化終末產(chǎn)物的形成。③晚期，二羰基化合物繼續(xù)與游離的氨基作用，形成不可逆的具有熒光性質(zhì)的AGEs。通過熒光測定，證明黃酮對AGEs有抑制作用。黑穗醋栗總黃酮對非酶糖基化反應(yīng)的三個階段的抑制作用都隨黃酮濃度的增加而增強，且最大抑制率分別為30.69%、48.15%、42.59%，其中對二羰基化合物形成的抑制作用較強。

4 結(jié)論

結(jié)果表明，黑穗醋栗總黃酮提取物對羥基自由基、超氧陰離子自由基和DPPH自由基均有較好的清除效果，清除能力與所測濃度有明顯的量效關(guān)系即隨濃度增加而增強。對非酶糖基化反應(yīng)中Amadori產(chǎn)物形成階段，二羰基化合物形成階段，AGEs形成過程有抑制作用，且抑制率隨黃酮濃度的增加而增強，其中對二羰基化合物形成抑制作用較強，具有一定抗非酶糖基化作用。

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