夏吉慶，馬添翼，鄭國香，王忠江，康德福，王麗麗

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)工程學(xué)院，哈爾濱 150030）

隨著全球新能源開發(fā)利用的深入，大力推進(jìn)生物質(zhì)能源的轉(zhuǎn)化研究尤為重要，厭氧發(fā)酵便是其中之一。國內(nèi)對(duì)于厭氧發(fā)酵中活性污泥微生物的多樣性研究處于起步階段，目前沒有有效方法進(jìn)行試驗(yàn)研究[1]。活性污泥微生物種類極其豐富，優(yōu)勢(shì)種群及其微生物多樣性在活性污泥生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。因此對(duì)厭氧發(fā)酵中活性污泥進(jìn)行研究分析，具有實(shí)際意義。因?yàn)椴捎脜捬醢l(fā)酵處理牛糞解決環(huán)境污染與提供生物質(zhì)能源方法較少。本研究在開展牛糞兩階段厭氧發(fā)酵的基礎(chǔ)上，采用PCR-DGGE(變性梯度凝膠電泳)技術(shù)對(duì)通過溢流輸送的發(fā)酵系統(tǒng)并帶有在線活性污泥和發(fā)酵后沼液混合回流的工藝達(dá)到穩(wěn)定運(yùn)行系統(tǒng)中的微生物菌群進(jìn)行分析，探討菌群的生長特性，為完善厭氧發(fā)酵系統(tǒng)提供參考。

DGGE具有可靠性強(qiáng)、重現(xiàn)性高、方便快捷，可以再現(xiàn)未被培養(yǎng)的微生物信息[2]，解決傳統(tǒng)方法片面性等優(yōu)點(diǎn)。DGGE技術(shù)在分析環(huán)境微生物群落多樣性和動(dòng)態(tài)性方面迅速得到應(yīng)用。目前證實(shí)DGGE技術(shù)在揭示自然界微生物區(qū)系的種群差異和遺傳多樣性等方面具有優(yōu)越性。該技術(shù)已經(jīng)成為微生物群落動(dòng)態(tài)和多樣性分析的有力工具之一[3-9]。

1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.1 試驗(yàn)工藝

本試驗(yàn)以牛糞為發(fā)酵原料，對(duì)實(shí)驗(yàn)室的厭氧發(fā)酵設(shè)備進(jìn)行相應(yīng)的改造?？蓪?shí)現(xiàn)從酸化罐到一級(jí)產(chǎn)氣罐、二級(jí)產(chǎn)氣罐及后沉池或后儲(chǔ)罐系統(tǒng)中的活性污泥沼液回流和溢流的兩階段（酸化階段和產(chǎn)氣階段獨(dú)立設(shè)置）的新型兩步序批式產(chǎn)氣溢流發(fā)酵系統(tǒng)。如圖1所示，料液首先從上部進(jìn)入酸化罐，由下部流出。再由一級(jí)產(chǎn)氣罐的上部進(jìn)入，由其下部流出。經(jīng)過二級(jí)產(chǎn)氣罐時(shí)是由其下部進(jìn)入從上部流出，最后由上部進(jìn)入后儲(chǔ)罐，主要是利用壓強(qiáng)差實(shí)現(xiàn)料液的溢流。

圖1 兩相厭氧溢流發(fā)酵系統(tǒng)裝置Fig.1 Apparatusfor two-phaseoverflow anaerobic fermentation

此系統(tǒng)的特點(diǎn)是大量減少了泵和閥的使用從而能夠降低故障的發(fā)生率。發(fā)酵系統(tǒng)可以將二級(jí)產(chǎn)氣罐和后儲(chǔ)罐中的活性污泥通過回流泵按一定比例回流到一級(jí)產(chǎn)氣罐的進(jìn)口處與酸化料液進(jìn)行混合，從而使酸化料液迅速進(jìn)入產(chǎn)甲烷氣階段。一級(jí)產(chǎn)氣罐和二級(jí)產(chǎn)氣罐還可以通過回流泵和閥門的控制實(shí)現(xiàn)各自本身的料液循環(huán)進(jìn)行液體的自身循環(huán)攪拌功能。

本系統(tǒng)通過對(duì)系統(tǒng)中的生態(tài)因子（溫度、PH值、進(jìn)料頻率等）進(jìn)行控制，以系統(tǒng)產(chǎn)氣率以及產(chǎn)氣甲烷含量等為目標(biāo)函數(shù)得出最佳污泥回流比、水力停留時(shí)間和物料濃度，當(dāng)系統(tǒng)達(dá)到穩(wěn)定運(yùn)行狀態(tài)時(shí)從系統(tǒng)中采集發(fā)酵料液進(jìn)行菌群生長特性及其動(dòng)態(tài)特性規(guī)律的研究和分析。

1.2 試驗(yàn)原料及其工藝性狀

試驗(yàn)原料為沼液，取自牛糞兩相厭氧發(fā)酵試驗(yàn)系統(tǒng)的穩(wěn)定產(chǎn)氣階段，研究對(duì)象為菌群。該發(fā)酵系統(tǒng)容積為12 m3，中溫30～35℃發(fā)酵，pH值為7.10～7.22，日產(chǎn)氣量為15.6～18.8 m3。

使用PHG-1101型PH/ORP計(jì)和SURE1011氣體渦輪流量計(jì)記錄的試驗(yàn)原料的工藝性狀如圖2所示。

圖2 試驗(yàn)材料的理化性質(zhì)Fig.2 Physicochemical propertiesof Experimental material

1.3 儀器

試驗(yàn)過程中所用主要試驗(yàn)儀器為DGGE（美國伯樂），PHG-1101型PH/ORP計(jì)（武漢優(yōu)測(cè)儀表有限公司），SURE1011氣體渦輪流量計(jì)（天津市訊爾儀表有限公司）。

2 方法

2.1 樣品的處理

為使試驗(yàn)樣品不受其他菌體的影響，取樣回來后立即放入通風(fēng)處，待變至室溫時(shí)再使用，用完后放入冰箱保持0℃不結(jié)冰。

2.2 DNA的提取

取牛糞厭氧發(fā)酵罐中微生物穩(wěn)定期的發(fā)酵液作為樣品。為保證條件的均一穩(wěn)定，將取好的樣品置于5 mL離心管中，4℃保存，最后統(tǒng)一進(jìn)行基因組DNA提取。

采用北京天恩澤基因科技有限公司的柱式糞便DNA提取試劑盒進(jìn)行樣品基因組DNA的提?。ň唧w步驟詳見試劑盒說明書）。采用濃度為0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其提取效果。結(jié)果表明條帶清晰明亮，DNA提取效果良好。

2.3 PCR擴(kuò)增

采用引物為1401R GC（5'CGGTGTGTACAA GACCC3'）和968F（5'AACGCGAAGAACCTTAC 3'）對(duì)樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

3 結(jié)果與分析

3.1 PCR圖譜

采用濃度為0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其擴(kuò)增效果，如圖3所示。

圖3 擴(kuò)增效果Fig.3 Graph of expanded results

3.2 樣品PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的DGGE電泳圖譜

結(jié)果見圖4。

采用Bio-Rad公司DcodeTM的基因突變檢測(cè)系統(tǒng)將PCR擴(kuò)增后的DNA進(jìn)行DGGE電泳。電泳結(jié)束后進(jìn)行銀染，染色后的凝膠用透射掃描儀掃描，獲取的凝膠譜圖如圖4所示。

由圖4可知，牛糞兩相厭氧發(fā)酵的活性污泥中的樣品的PCR產(chǎn)物經(jīng)DGGE分離出了數(shù)目、強(qiáng)度以及遷移位置都不同的條帶。而這些不同位置的條帶代表不同的細(xì)菌種群：電泳條帶越多，細(xì)菌種群越多；條帶信號(hào)越強(qiáng)，該條帶代表的相應(yīng)細(xì)菌數(shù)量也越多[11]。由圖4可看出活性污泥中細(xì)菌種群較多，優(yōu)勢(shì)種群明顯。根據(jù)DGGE圖譜4可以看出，體系微生物群落的變化呈現(xiàn)出以下幾方面特點(diǎn)：降解開始時(shí)的圖譜條帶較多，但強(qiáng)度稍弱。隨著降解過程的不斷進(jìn)行，部分微生物種群逐漸減少，甚至消失，如Band-3，Band-15；有的微生物種群在降解過程中出現(xiàn)波動(dòng)降解的過程：降解初期數(shù)量較少，而進(jìn)入降解中期數(shù)量開始逐漸增多，最后降解末期又逐漸減少，如Band-6，Band-7；此外還有一些微生物種群的數(shù)量在降解過程中一直較少，直至降解末期才開始逐漸增多，如Band-2。

圖4 DGGE電泳圖譜Fig.4 DGGEelectrophorogram

3.3 DGGE圖譜條帶的序列比對(duì)結(jié)果

將DGGE圖譜上的條帶經(jīng)膠回收后進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化，同時(shí)將得到的菌液送上海生工測(cè)序。測(cè)序結(jié)果經(jīng)Blast程序與GenBank數(shù)據(jù)庫中序列進(jìn)行局部同源性比較，比對(duì)結(jié)果如表2所示。大多數(shù)條帶的16srDNA序列比對(duì)結(jié)果與數(shù)據(jù)庫中序列的相似度超過95%，由此可以確定試驗(yàn)結(jié)果中這些條帶代表的微生物與數(shù)據(jù)庫中最相近的微生物屬于同一個(gè)屬。

表2 DGGE圖譜中不同條帶的序列比對(duì)結(jié)果Table 2 Sequence alignment analysis of DGGE spectrums bands

Verrucomicrobia疣微菌門是一門被劃出不久的細(xì)菌。包括少數(shù)幾個(gè)被識(shí)別的種類，主要被發(fā)現(xiàn)于淡水、海水和土壤環(huán)境、人類糞便中，或者城市固體垃圾填埋滲濾液產(chǎn)甲烷反應(yīng)堆體系中。還有很多未被成功培養(yǎng)的種類是和真核宿主共生的，包括一些原核生物的外共生菌和線蟲動(dòng)物配子中的內(nèi)共生菌。這種菌生長在極端的厭氧的條件下，將甲烷作為其唯一的能量來源。是一種新型的甲烷氧化菌。Chloroflexi綠彎菌門是在污水處理過程中豐富的生物脫氮除磷菌。經(jīng)常在上流式厭氧污泥床處理高濃度有機(jī)廢水中及活性污泥污水處理廠中被發(fā)現(xiàn)。Chloroflexi成員在處理城市污水的MBR的生態(tài)中可以降低膜污染的存在。Acetivibrio sp.多分離于垃圾污泥和豬糞中。成對(duì)或鏈排列，運(yùn)動(dòng)，中溫生長，最適生長溫度是35℃，化能有機(jī)營養(yǎng)，發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生乙酸，其他可能的產(chǎn)物有乙醇、CO2和H2，但不產(chǎn)生丙酸和乳酸。解纖維醋弧菌(Acetivibriocellulolyticus)對(duì)于發(fā)酵液中的不良環(huán)境有較好的耐受和調(diào)節(jié)能力，對(duì)揮發(fā)酸的生成起著重要作用。Lentisphaerae是黏膠球形菌門。Deltaproteobacteria出菇體形成的粘細(xì)菌在不利的環(huán)境釋放myxospores，并嚴(yán)格厭氧屬，其中包含大部分已知的一個(gè)分支硫酸鹽（脫硫，Desulfobacter，Desulfococcus，Desulfonema等）和硫還原菌（如Desulfuromonas SPP）。以及其他幾個(gè)具有不同的生理厭氧細(xì)菌。

從表3可以看出，微生物種類繁多，而且涉及黏膠球形菌門、β-變形菌綱、疣微菌綱等多個(gè)菌綱，同時(shí)也說明了微生物群落組成的多樣性。

4 結(jié)論

a.利用分子生物學(xué)技術(shù)PCR-DGGE分析了兩相厭氧溢流發(fā)酵工藝穩(wěn)定期時(shí)的菌群結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明，具有溢流輸送發(fā)酵系統(tǒng)并結(jié)合在線活性污泥和發(fā)酵后沼液混合回流的反應(yīng)系統(tǒng)可以穩(wěn)定可靠的運(yùn)行。

b.DGGE圖譜顯示，活性污泥微生物穩(wěn)定期細(xì)菌種群較豐富，優(yōu)勢(shì)種群明顯，群落結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。

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