單德鑫，付秋玥，丁 麗

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150030）

酚類物質(zhì)是煤氣廢水中有機(jī)污染物的主要成分，約占總有機(jī)物的60%～80%。通過使用色質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對哈爾濱某氣化廠有機(jī)物進(jìn)行分析，測得原水中的酚類物質(zhì)達(dá)19種[1]。煤氣站循環(huán)水中揮發(fā)酚的含量高達(dá)1 500～3 200 mg·L-1，以褐煤為燃料的廢水含酚量為500～6 000 mg·L-1，而國家排放標(biāo)準(zhǔn)酚的最高允許排放濃度0.5 mg·L-1[2]。隨著污水排放標(biāo)準(zhǔn)的不斷提高，煤氣廢水的處理已受到越來越多的關(guān)注。

活性污泥法是當(dāng)前應(yīng)用最為廣泛的處理煤氣廢水中酚類物質(zhì)的方法之一，其中，向活性污泥處理系統(tǒng)中投放高效酚降解菌，能夠大大提高微生物系統(tǒng)對酚的耐受能力，進(jìn)而提高酚的去除率和降解速率，縮短處理時間[3]。

以哈爾濱某氣化廠生化車間活性污泥為菌源，在不同濃度間甲苯酚無機(jī)鹽培養(yǎng)基上培養(yǎng)，篩選出間甲苯酚優(yōu)勢降解菌并對其降解性能進(jìn)行研究，為生物強(qiáng)化高效優(yōu)勢菌技術(shù)在廢水處理應(yīng)用提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來源

活性污泥取自哈爾濱某氣化廠生化處理車間，試驗(yàn)所用廢水為氣化廠造氣廢水（原水）。

1.1.2 間甲苯酚無機(jī)鹽培養(yǎng)基

培 養(yǎng) 基 是 以 K2HPO42.24 g·L-1，KH2PO42.74 g·L-1，(NH4)2SO41.00 g·L-1，MgCl2·6H2O 0.2 g·L-1，CaCl20.01 g·L-1，F(xiàn)eCl3·6H2O 0.02 g·L-1，NaCl 0.1 g·L-1配制的間甲苯酚無機(jī)鹽培養(yǎng)基，pH 7.4～7.6，于112℃滅菌20 min后，根據(jù)試驗(yàn)需要加入適量間甲苯酚制成唯一碳源培養(yǎng)基，備用。

1.2 方法

1.2.1 含酚量的測定

含酚量的測定采用4-氨基安替比林直接吸光光度法[4]。

1.2.2 菌液濃度的測定

菌液濃度以O(shè)D值表示，利用其在610 nm波長下有最大吸光度的方法進(jìn)行測定[4]。

1.2.3 菌種的分離純化與篩選

試驗(yàn)中，將廢水與啤酒按1:9比例混合，使廢水中的營養(yǎng)物質(zhì)增加，然后在混合廢水中加入一定量活性污泥，開始活性污泥的培養(yǎng)與馴化過程，連續(xù)曝氣36 h。采用直接分離純化法得到能夠利用間甲苯酚作為唯一碳源的菌種。將各菌懸液按5%的比例分別加入到含間甲苯酚量為300、500、600 mg·L-1的無機(jī)鹽培養(yǎng)基內(nèi)，30 ℃，120 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)，每隔3 h分別測定上述各培養(yǎng)液的間甲苯酚含量，計算各菌種在不同酚含量條件下間甲苯酚的降解率，從而確定其中的高效降解菌。

1.2.4 生長條件試驗(yàn)

在不同溫度（15、20、25、30、35、40 ℃）、pH（3、5、7、9、12）和外加碳源（葡萄糖）濃度（0、300、500 mg·L-1）條件下，測定菌種對間甲苯酚的降解率，討論各種外部條件對菌種降解能力的影響。

1.2.5 菌種鑒定

1.2.5.1 菌種形態(tài)觀察

記錄平板培養(yǎng)基上菌落的生長特征，液體培養(yǎng)基內(nèi)是否呈混濁、絮狀、粘液狀，是否形成菌膜和沉淀等。

1.2.5.2 菌種生理生化鑒定

對所得菌種進(jìn)行以下生理生化試驗(yàn)：革蘭氏染色、接觸酶、甲基紅（M.R）、V-P測定、淀粉水解、葡萄糖氧化發(fā)酵、氧化酶、硝酸鹽還原、產(chǎn)氨試驗(yàn)、產(chǎn)吲哚試驗(yàn)、明膠液化和石蕊牛奶試驗(yàn)。

1.2.5.3 菌種分子鑒定

對菌種進(jìn)行分子鑒定，引物序列為16S F 5'AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3'；16S R 5'GGCTA CCTTGTTACGACTT 3'。

取1～2 μL用于Promega公司pGEM-T Easy載體連接反應(yīng)并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取白斑搖菌后送北京市理化分析測試中心測序。將測得序列在GenB ank上進(jìn)行Blast比對，根據(jù)所得測序結(jié)果，利用NCBI提供的Blastn工具在GenBank數(shù)據(jù)庫中找到同源序列。

2 結(jié)果與分析

2.1 間甲苯酚優(yōu)勢降解菌的篩選

在平板培養(yǎng)基上共分離得到菌株27個，分別接種于含有不同濃度間甲苯酚的選擇培養(yǎng)基上，30℃恒溫培養(yǎng)48 h后，得到對間甲苯酚耐受能力最強(qiáng)的細(xì)菌2株，命名為JD-1和JD-2。

如圖1所示，通過在不同間甲苯酚含量條件下，對JD-1、JD-2降解效果和降酚速率的比較可見，JD-2菌的降酚率明顯高于JD-1，在含酚量為300、500和600 mg·L-1時，JD-2菌的降酚速率分別在9、9和27 h達(dá)到最大，降酚率分別為99.63%、99.59%、99.50%，表明該菌種具有較強(qiáng)耐負(fù)荷沖擊能力；而JD-1對應(yīng)時間則為9、33和30 h。因此，確定JD-2菌為間甲苯酚優(yōu)勢降解菌。

圖1 不同間甲苯酚含量的條件下JD菌的降解速率Fig.1 Degradation rate of JD bacteria on the different concentrations of M-cresol

2.2 降解菌的特性研究

2.2.1 溫度對降酚效果的影響

由圖2可知，間甲苯酚優(yōu)勢降解菌JD-2的最適溫度為30℃。

圖2 溫度對JD-2生長與降酚率的影響Fig.2 Effects of temperature on growth and degradation efficiency of JD-2

2.2.2 pH值對降酚效果的影響

由圖3可知，JD-2菌的最適pH范圍為7～9，同時對間甲苯酚的降解效果較好，當(dāng)pH值為11時，該菌株菌液OD僅為0.065，間甲苯酚的降酚率幾乎為0，說明在強(qiáng)堿性的條件下，JD-2菌幾乎不能生長。

2.2.3 外加碳源對降解效果的影響

由圖4可知，加入一定濃度的葡萄糖溶液能夠促進(jìn)JD-2對間甲苯酚的降解作用，降酚率也有所提高。在前3 h，加入500 mg·L-1葡萄糖的培養(yǎng)液降酚率高于含葡萄糖量為300 mg·L-1，其降酚率分別為39.35%和32.34%，未加入葡萄糖溶液的無機(jī)鹽培養(yǎng)基內(nèi)降酚率僅為26.30%，隨后，含葡萄糖量為300 mg·L-1培養(yǎng)液的降酚率逐漸提高，12 h后降酚率達(dá)到98.99%，明顯高于其他兩組培養(yǎng)液。由碳源降解試驗(yàn)可知，JD-2菌不僅能夠利用間甲苯酚作為唯一碳源，而且能夠利用其他物質(zhì)（如葡萄糖）作為碳源，促進(jìn)間甲苯酚的降解。

圖3 pH值對JD-2生長及降酚率的影響Fig.3 Effects of pH on growth and degradation efficiency of JD-2

圖4 不同碳源量對JD-2菌降酚效果的影響Fig.4 Effects of different carbon source concentration on degradation efficiency of JD-2

2.3 菌種鑒定

2.3.1 菌種形態(tài)特征觀察

JD-2菌在瓊脂平板上呈乳脂狀，為乳白色，半透明，單菌落為圓形，邊緣為鋸齒狀，臍狀凸起，菌體濕潤光滑，易挑起；在液體培養(yǎng)基內(nèi)能夠均勻生長，不形成菌膜，無沉淀。

2.3.2 菌種生理生化鑒定

間甲苯酚優(yōu)勢降酚菌JD-2，在革蘭氏染色試驗(yàn)中呈陰性，能夠氧化葡萄糖產(chǎn)酸，使石蕊牛奶產(chǎn)堿變藍(lán)。其他生理生化試驗(yàn)結(jié)果見表2。

2.3.3 菌種的分子鑒定

菌株JD-2基因測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中序列比對結(jié)果表明，該菌株的基因序列與在Genbank數(shù)據(jù)庫中登記的多株假單胞菌屬的菌株具有高度同源性，同源性均在99%以上，見表3。其中與該菌株同源性最高的是Pseudomonas sp.SMIC-5，同源性達(dá)100%。由16S rRNA測序鑒定結(jié)果可知，間甲苯酚優(yōu)勢降解菌JD-2為假單胞菌屬。

表2 生理生化試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of physiological and biochemical experiment

表3 JD-2菌16S rRNA序列Blast結(jié)果Table 3 JD-2 strain 16S rRNA sequence blast

3 討論與結(jié)論

本研究通過富集培養(yǎng)方法，從氣活性污泥中分離一株高效間甲苯酚降解菌，這種方法通過不斷提高富集時間甲苯酚的濃度，使降解能力強(qiáng)、對間甲苯酚耐受力強(qiáng)的菌株得到選擇性生長，并且富集過程稀釋了污泥中有機(jī)質(zhì)的含量，使后期在含間甲苯酚的選擇培養(yǎng)基上篩選間甲苯酚降解菌可行。以間甲苯酚為基質(zhì)，通過篩選高效降解菌和對基質(zhì)共代謝技術(shù)處理含酚廢水進(jìn)行研究，了解最佳降解條件，以期為工程應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

以間甲苯酚作為基質(zhì)，從活性污泥中分離篩選出對間甲苯酚耐受能力最強(qiáng)的2株菌命名為JD-1和JD-2。由間甲苯酚含量分別為300、500、600 mg·L-1的降解試驗(yàn)對比結(jié)果可知，JD-2菌的降酚率和降酚速率均明顯高于JD-1，由此確定，JD-2菌為間甲苯酚優(yōu)勢降解菌。

在36 h試驗(yàn)時間內(nèi)，含酚量為300、500、600 mg·L-1的條件下，降解速率達(dá)到最高水平所用時間分別為9、9、27 h，經(jīng)過36 h的降解，降酚率分別為99.63%、99.59%、99.50%。本試驗(yàn)培養(yǎng)的間甲苯酚優(yōu)勢降解菌JD-2對間甲苯酚具有較強(qiáng)的耐負(fù)荷沖擊能力。

由特性研究結(jié)果可知，菌株JD-2在6～18 h均保持良好活性，其最佳降解條件為溫度為30℃，pH 7～9，葡萄糖量500 mg·L-1。同時可知，加入一定濃度的葡萄糖溶液對酚類物質(zhì)的降解有良好促進(jìn)作用。經(jīng)一系列生理生化試驗(yàn)鑒定和16S rRNA測序比對，初步判斷菌株JD-2為假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）。

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