王波,萬(wàn)修陽(yáng),陳德喜

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬青島市海慈醫(yī)院骨傷科,山東青島 266033)

壯骨顆粒對(duì)骨折愈合中HIF-1α分泌及骨痂形成影響

王波,萬(wàn)修陽(yáng),陳德喜

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬青島市海慈醫(yī)院骨傷科,山東青島 266033)

目的探討壯骨顆粒對(duì)動(dòng)物模型骨折斷端缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)分泌與骨痂形成的影響。方法32只新西蘭大白兔隨機(jī)分成壯骨顆粒組和對(duì)照組,各16只。建立兔左前肢橈骨骨折模型,壯骨顆粒組給予壯骨顆粒灌胃治療,對(duì)照組給予安慰劑,分別于術(shù)后1、2、4、8周拍X線片,盲法對(duì)外骨痂和骨折線進(jìn)行定量評(píng)價(jià);取骨折處骨標(biāo)本,行免疫組化染色,檢測(cè)骨痂組織HIF-1α陽(yáng)性強(qiáng)度。結(jié)果壯骨顆粒組、對(duì)照組外骨痂與骨折線評(píng)分隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增加,差異有顯著性(F＝555.63、458.82,P＜0.01);從第2周開(kāi)始,壯骨顆粒組與對(duì)照組外骨痂與骨折線評(píng)分比較,差異有顯著性(F＝6.51～134.14,P＜0.05)。骨折后第1周兩組均未見(jiàn)HIF-1α陽(yáng)性染色;骨折2周后,兩組組內(nèi)不同時(shí)間比較、兩組間同一時(shí)間HIF-1α陽(yáng)性強(qiáng)度比較,差異均有顯著性(F＝6.76～64.93,P＜0.05)。結(jié)論壯骨顆粒可促進(jìn)HIF-1α在骨痂組織中的表達(dá),加速骨痂生成,提高骨痂質(zhì)量。

骨折愈合;骨痂;缺氧誘導(dǎo)因子1;壯骨顆粒

骨折的愈合需要具備三方面的條件:骨折斷端穩(wěn)定的固定、骨折處足夠量具有成骨能力的細(xì)胞(包括向成骨及成軟骨方向定向分化的間充質(zhì)細(xì)胞及成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞)及骨折斷端豐富的血運(yùn)[1]。中藥治療骨折有很好的效果。本文在以往研究的基礎(chǔ)上,探討中藥壯骨顆粒對(duì)骨折的治療作用及其機(jī)制,以更好地指導(dǎo)臨床?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

健康新西蘭大白兔32只,10月齡,雌雄各半,體質(zhì)量2.0～2.2 kg。壯骨顆粒(組方:補(bǔ)骨脂、淫羊藿、山茱萸、煅狗骨、黨參、補(bǔ)骨脂、自然銅等,原藥材購(gòu)自青島市醫(yī)藥公司),青島市海慈醫(yī)療集團(tuán)制劑室加工制備,每克顆粒含原生藥2.9 g。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

新西蘭大白兔隨機(jī)分為壯骨顆粒組和對(duì)照組,每組16只,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后均制備左側(cè)橈骨中段骨折模型。骨折模型制備方法:兔前肢脫毛,耳緣靜脈進(jìn)行麻醉;常規(guī)消毒,鋪巾,取前肢下段內(nèi)側(cè)約4 cm切口,常規(guī)切開(kāi)皮膚,暴露橈骨,在橈骨旋前圓肌止點(diǎn)遠(yuǎn)端,用線鋸造成3 mm的骨缺損[2]。沖洗,縫合皮層,骨折不固定,清潔紗布包扎傷口。術(shù)后每只兔均肌肉注射青霉素40萬(wàn)單位,連續(xù)注射3 d。分籠飼養(yǎng),注意清潔衛(wèi)生。壯骨顆粒組給予壯骨顆粒0.5 g/kg(生藥)灌胃,每天3次;對(duì)照組給予安慰劑,劑量用法同壯骨顆粒組。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)及方法

術(shù)后1、2、4、8周,隨機(jī)從兩組中各選4只大白兔進(jìn)行X線攝片,采用盲法對(duì)外骨痂和骨折線進(jìn)行定量評(píng)價(jià)[2-3];然后將兔處死,從骨折處取長(zhǎng)度為1 cm的骨標(biāo)本(保留骨膜組織),置于40 g/L的多聚甲醛溶液中4℃環(huán)境下固定48 h,再放入150 g/ L的EDTA溶液中脫鈣2周,3 d更換脫鈣液1次。脫鈣后,經(jīng)梯度乙醇逐級(jí)脫水后,石蠟縱向包埋,切片,厚度5μm,行免疫組化染色。顯微鏡下(100倍)觀察,每個(gè)標(biāo)本取5張切片,每張切片隨機(jī)取5個(gè)視野,測(cè)定HIF-1α陽(yáng)性強(qiáng)度,取其均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,計(jì)量資料結(jié)果用±s表示,數(shù)據(jù)間比較采用析因設(shè)計(jì)的方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 兩組外骨痂與骨折線評(píng)分比較

第1周壯骨顆粒組骨痂沒(méi)有形成,骨小梁不明顯;對(duì)照組大量的纖維組織增生,少量骨痂生成。第2周開(kāi)始,壯骨顆粒組與對(duì)照組開(kāi)始出現(xiàn)骨痂。第4周,壯骨顆粒組骨痂量明顯增多,部分動(dòng)物骨折斷端被骨痂完全充填。第8周壯骨顆粒組骨折斷端骨折線消失,骨膜反應(yīng)明顯;對(duì)照組骨折斷端模糊,骨膜反應(yīng)密度淺淡,骨痂量少。壯骨顆粒組、對(duì)照組外骨痂與骨折線評(píng)分隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增加,差異有顯著性(F＝555.63、458.82,P＜0.01)。從第2周開(kāi)始,壯骨顆粒組與對(duì)照組外骨痂和骨折線評(píng)分比較,差異有顯著性(F＝6.51～134.14,P＜0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 兩組HIF-1α陽(yáng)性強(qiáng)度比較

骨折后第1周兩組均未見(jiàn)HIF-1α陽(yáng)性染色;骨折后2周,壯骨顆粒組與對(duì)照組骨折斷端、骨外膜下及周圍軟組織形成的血腫內(nèi)有大量的細(xì)胞增殖分化,這些細(xì)胞間質(zhì)中HIF-1α染色陽(yáng)性;骨折后4周,骨痂中成骨細(xì)胞著色較深,壯骨顆粒組較對(duì)照組HIF-1α陽(yáng)性表達(dá)數(shù)目多;骨折后8周,兩組中成骨細(xì)胞成熟,骨小梁周圍HIF-1α表達(dá)較弱。兩組組內(nèi)不同時(shí)間比較、兩組間同一時(shí)間比較,HIF-1α陽(yáng)性強(qiáng)度差異有顯著性(F＝6.76～64.93,P＜0.05)。見(jiàn)表2。

3 討 論

近年來(lái)出現(xiàn)了許多可以促進(jìn)骨折愈合的方法,其機(jī)制為促進(jìn)細(xì)胞活性、促進(jìn)骨痂生成、調(diào)節(jié)骨細(xì)胞基因序列的表達(dá)、干預(yù)骨生長(zhǎng)因子的生成等[4-7]。中藥可在骨折愈合不同時(shí)期發(fā)揮修復(fù)作用[2]。壯骨顆粒以中醫(yī)“腎主骨”、“補(bǔ)先后天”理論為原則組方而成,主要由煅狗骨、淫羊藿、山茱萸、黨參、補(bǔ)骨脂及自然銅等藥組成?，F(xiàn)代研究表明,按骨折愈合過(guò)程,在血腫機(jī)化期,煅狗骨、淫羊藿、山茱萸、黨參、補(bǔ)骨脂等活血化瘀藥可以促進(jìn)微循環(huán)代謝,增加骨折斷端局部血運(yùn),清除血凝塊及代謝產(chǎn)物,起到消腫止痛、促進(jìn)骨細(xì)胞生成作用[8-9]。

表1 兩組不同時(shí)間外骨痂與骨折線評(píng)分比較(n＝4,±s)

__組__別______1周2周4周8周對(duì) 照 組0.835±0.754 6.551±1.047 18.505±1.374 25.785±1.023壯骨顆粒組2.831±0.980 9.168±1.169 21.335±2.064 35.465±1.564

表2 兩組術(shù)后不同時(shí)間骨痂標(biāo)本中HIF-1α陽(yáng)性強(qiáng)度比較(n＝20,±s)

____組__別___________________________________________________ ________2周4周8周對(duì) 照 組2.67±0.23 3.12±0.37 2.01±0.05 __壯骨顆粒組____3.56±0.09____4.23±0.6____________________ 7 2.11±0.07

HIF-1是體內(nèi)細(xì)胞在低氧環(huán)境中產(chǎn)生的一種結(jié)合DNA蛋白質(zhì)因子,參與對(duì)低氧反應(yīng)基因的調(diào)控,從而使人體對(duì)低氧刺激作出復(fù)雜的病理生理反應(yīng)。已有研究表明,低氧-HIFα通路調(diào)節(jié)骨發(fā)育與骨形成過(guò)程,在骨和關(guān)節(jié)形成、發(fā)育進(jìn)程中,HIF-1α表達(dá)具有與骨生長(zhǎng)進(jìn)程相關(guān)聯(lián)的顯著時(shí)空特征[10-13]。

本文結(jié)果顯示,骨折2周后,壯骨顆粒組與對(duì)照組組內(nèi)不同時(shí)間比較、兩組間同一時(shí)間比較,HIF-1α陽(yáng)性強(qiáng)度差異均有顯著性。提示壯骨顆?？纱龠M(jìn)兔骨折愈合并促進(jìn)成骨活躍,提高骨折的愈合質(zhì)量。其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)骨代謝相關(guān)因子、促進(jìn)骨折局部骨痂形成,調(diào)節(jié)血清微量元素等有關(guān)。

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(本文編輯 黃建鄉(xiāng))

THE EFFECT OF ZHUANGGU GRANULA ON SECRETION OF HIF-1αAND CALLUS FORMATION IN FRACTURE HEALING

WANG Bo,WAN Xiuyang,CHEN Dexi (Department of Orthopedics,Qingdao Hiser Hospital,Qingdao 266033,China)

ObjectiveTo investigate the effect of Zhuanggu granula on secretion of HIF-1αand callus formation in animal model with fracture.MethodsA total of 32 New Zealand rabbits were equally randomized to two groups.A model of left radius fracture was created in rabbits.Intragastric administration of Zhunggu granula was given to rabbits in the Zhunggu granula group,and to those in the control,placebo was offered.X-ray films were taken 1,2,4 and 8 weeks after surgery.The blind method was used to quantitatively assess external callus and fracture line.Bone samples from the fractured part were taken and stained by immunohistochemisty to determine positive HIF-1αin bony callus.ResultsThe score of external callus and fracture line in both groups was increased along with the extension of duration,the different was significant.The differences of scores of external callus and fracture line between Zhuanggu granula and control group were significant beginning from the second week(F＝6.51－134.14,P＜0.05).No positive staining of HIF-1αwas found on the first week of fracture;after two weeks,the positive expression of HIF-1αof different time points in the same group,and that of the same time point between the two groups were significant(F＝6.76－64.93,P＜0.05).ConclusionZhuanggu granula can promote the secretion of HIF-1αin bone callus,and accelerate its formation and raise its quality.

fracture healing;bony callus;hypoxia-inducible factor 1;Zhuanggu granula

R683.41

A

1008-0341(2013)04-0359-03

10.11712/qlyx201304026

2013-01-04;

2013-06-06

青島市科技發(fā)展計(jì)劃(07-2-1-20-nsh)

王波(1979-),男,在讀碩士研究生。

陳德喜(1959-),男,教授,碩士生導(dǎo)師。