金巖,宋揚,陳沉

(青島大學醫(yī)學院營養(yǎng)研究所,山東青島 266021)

刺參酸性黏多糖對人肝癌Hep G2細胞增殖的影響

金巖,宋揚,陳沉

(青島大學醫(yī)學院營養(yǎng)研究所,山東青島 266021)

目的了解刺參酸性黏多糖(SJAMP)對體外培養(yǎng)的人肝癌Hep G2細胞增殖的影響。方法體外培養(yǎng)HepG2細胞,MTT法檢測SJAMP對細胞增殖的影響,流式細胞術(shù)檢測細胞周期,免疫細胞化學法檢測細胞增殖細胞核抗原(PCNA)表達,以正常肝細胞(張氏細胞)作為對照。結(jié)果SJAMP能抑制Hep G2細胞增殖,且隨著干預劑量(0、0.5、2.0、8.0 mg/L)和干預時間(12、24、48 h)延長其抑制作用增強(F＝68.430～596.680,q＝3.714～55.029,P＜0.05);不同濃度SJAMP作用對張氏細胞增殖無明顯的抑制作用(P＜0.05)。隨著SJAMP劑量的增加,Hep G2細胞停留在G1期比例增加,S期、G2期的細胞減少(F＝4.483～18.791,q＝1.921～9.876,P＜0.05);對于張氏細胞,SJAMP作用后其細胞周期未發(fā)生顯著改變(P＞0.05)。SJAMP作用后HepG2細胞的PCNA表達降低,且隨著SJAMP作用劑量的增加而降低(F＝2 688.640,q＝55.365～156.296,P＜0.05);張氏細胞PCNA表達未發(fā)生顯著變化(P＞0.05)。結(jié)論SJAMP通過誘導HepG2細胞發(fā)生細胞周期G1期阻滯并抑制其PCNA表達,從而抑制Hep G2細胞增殖,發(fā)揮抗腫瘤作用。

多糖;刺參屬(動物);肝腫瘤;細胞增殖

刺參酸性黏多糖(SJAMP)為海洋腔腸類動物體內(nèi)富含的一類天然海洋活性物質(zhì)。近來研究表明,SJAMP具有抗腫瘤活性,成為抗腫瘤藥物研究的熱點[1]。目前,國內(nèi)外對SJAMP抗腫瘤作用的研究多集中在其對機體免疫系統(tǒng)作用方面[2-4],其對腫瘤的直接抑制作用研究較少。我們的前期研究結(jié)果顯示,SJAMP對二乙基亞硝胺(DEN)誘導的大鼠肝腫瘤具有抑制作用,能夠降低其腫瘤發(fā)生率[5],但SJAMP直接作用于肝腫瘤細胞產(chǎn)生的作用及其機制尚待探討。本研究以人肝癌細胞株Hep G2細胞為實驗細胞株,人正常肝細胞(張氏細胞)株為對照,探討SJAMP對細胞增殖的影響,為SJAMP抗腫瘤機制研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系 人肝癌細胞系Hep G2、人正常肝細胞張氏細胞系,購自中國科學院上海細胞庫。

1.1.2 主要試劑 SJAMP,購自中國海洋大學食品科學與工程學院;高糖DMEM培養(yǎng)液、1640培養(yǎng)液及胎牛血清,均為美國Hyclone公司產(chǎn)品;四甲基偶氮唑鹽(MTT),Sigma公司產(chǎn)品;細胞周期與凋亡檢測試劑盒,碧云天生物技術(shù)研究所產(chǎn)品;兔抗人增殖細胞核抗原(PCNA)蛋白抗體、SP-0023試劑盒均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備 恒溫CO2培養(yǎng)箱;Olympus顯微鏡;酶標儀;流式細胞儀;超凈工作臺等。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) HepG2細胞常規(guī)培養(yǎng)于含體積分數(shù)0.10胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液,張氏細胞培養(yǎng)于含體積分數(shù)0.10胎牛血清的1640培養(yǎng)液,置于于37℃、含體積分數(shù)0.05 CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 MTT法檢測SJAMP對細胞增殖的影響①常規(guī)培養(yǎng)Hep G2細胞和張氏細胞,取對數(shù)生長期的細胞,用2.5 g/L胰蛋白酶消化制成細胞懸液,密度為1×1010/L。②將制備好的細胞懸液接種到96孔板,每個劑量組設(shè)5個平行孔,每孔200μL。置37℃、含體積分數(shù)0.05 CO2培養(yǎng)箱中孵育過夜,待細胞貼壁。③棄去各孔培養(yǎng)液,換含有不同濃度SJAMP(0、0.5、2.0、8.0 mg/L)的培養(yǎng)液(內(nèi)含體積分數(shù)0.10胎牛血清),分別培養(yǎng)12、24、48 h。④加入5 g/L的MTT溶液20μL,放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h后,吸出各孔中的液體,每孔加入150μL的DMSO,快速振蕩1 min,待結(jié)晶產(chǎn)物充分溶解后,酶標儀測490 nm波長處各孔吸光度(A)值,計算各組A值平均值及干預48 h時不同濃度SJAMP對Hep G2細胞抑制率。抑制率＝(未干預組A值－干預組A值)/未干預A值×100%。

1.2.3 碘化丙啶(PI)染色流式細胞術(shù)檢測細胞周期 ①取對數(shù)生長期細胞,2.5 g/L胰酶消化后制成細胞懸液,密度為1×107/L,接種于6孔板,每個劑量組設(shè)3個平行孔,置于37℃、含體積分數(shù)0.05 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。②吸出每孔培養(yǎng)液,換含有不同濃度SJAMP(0、0.5、2.0、8.0 mg/L)的培養(yǎng)液(內(nèi)含體積分數(shù)0.10胎牛血清)繼續(xù)培養(yǎng)24 h。③2.5 g/L胰酶消化各孔細胞,以1 000 r/min離心3 min,PBS清洗2次,體積分數(shù)0.70冰乙醇固定細胞4 h,冰浴PBS清洗細胞,以1 000 r/min離心3 min。④加PI染液,緩慢并充分重懸細胞,37℃避光溫浴30 min后,流式細胞儀檢測。

1.2.4 免疫細胞化學法檢測PCNA的表達 ①處理細胞爬片:載玻片經(jīng)酸、乙醇、多聚賴氨酸浸泡后,高壓滅菌。②消化細胞,制備細胞懸液,密度為5× 107/L。將高壓滅菌處理的載玻片置于細胞培養(yǎng)皿中,玻片中央滴兩滴制備好的細胞懸液,培養(yǎng)皿置于37℃、體積分數(shù)0.05 CO2培養(yǎng)箱中,待細胞完全貼壁后,每個培養(yǎng)皿中加入含體積分數(shù)0.10胎牛血清的培養(yǎng)液。12 h后,棄去各培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液,換含不同濃度SJAMP(0、0.5、2.0、8.0 mg/L)的培養(yǎng)液(含體積分數(shù)0.10胎牛血清)。③24 h后,取出玻片,PBS沖洗3次,冰丙酮固定5 min。④向玻片上滴加體積分數(shù)0.01的Trition-X100溶液,10 min后,PBS沖洗3次。⑤滴加體積分數(shù)0.3的H2O2, 15 min后,PBS沖洗3次。⑥按照SP-0023試劑盒說明書進行免疫細胞化學染色,DAB顯色,蘇木精復染,梯度乙醇脫水,中性樹膠封片。細胞核中出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為陽性。光鏡下隨機選擇5個以上高倍視野(600倍),每個視野計數(shù)100個細胞,計算陽性細胞指數(shù)(%)。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度SJAMP作用不同時間對Hep G2細胞和張氏細胞增殖的影響

對于Hep G2細胞,在干預時間相同條件下,隨著SJAMP干預濃度的升高,A值顯著降低(F＝68.430～596.680,q＝3.714～55.029,P＜0.05);干預劑量相同時,24 h組A值與12 h組比較明顯升高,48 h組與24 h組比較升高不明顯。3個干預組作用48 h后的抑制率分別為11.13%、14.92%、18.63%。見表1。對于張氏細胞,相同時間、不同濃度SJAMP干預后,各組A值差異無顯著性(F＝0.462～0.629,P＞0.05);同一干預濃度條件下,隨著干預時間的延長,各組A值均明顯升高,差異有顯著性(F＝55.597～199.703,q＝6.357～29.275, P＜0.05)。見表2。

2.2 不同濃度SJAMP對細胞周期的影響

SJAMP干預使HepG2細胞的細胞周期發(fā)生變化,停留在G1期的細胞增多,S期和G2期的細胞減少,隨著SJAMP干預濃度的增加而變化,各組比較差異有顯著性(F＝4.403～18.791,q＝1.921～9.876,P＜0.05)。見表3。對于張氏細胞,不同濃度SJAMP作用后,細胞處于G1、S、G2期的比例未發(fā)生顯著改變(P＞0.05)。見表4。

2.3 不同濃度SJAMP對PCNA表達的影響

不論是否有SJAMP干預,Hep G2細胞和張氏細胞中均有PCNA的表達。對于Hep G2細胞,隨著SJAMP濃度增加,PCNA表達降低,各組比較差異有顯著性(F＝2 688.640,q＝55.365～156.296, P＜0.05)。對于張氏細胞,不同濃度SJAMP干預后,其PCNA表達未出現(xiàn)明顯的變化(P＞0.05)。見表5。

表1 不同濃度SJAMP干預不同時間對HepG2細胞A值的影響(n＝5，±s)

SJAMP濃度_(ρ/mg·L－1)______ _______________________________________________作用時間(t/h) 12____________________________________ _24________ 48 0 1．631±0．015 1．777±0．026 1．807±0．018 0．5 1．580±0．013 1．615±0．012 1．606±0．007 2．0 1．507±0．008 1．526±0．016 1．537±0．005 ______8．0_______1．424±0．083__1．452±0_____________________．015 1．470±0．017

表2 不同濃度SJAMP干預不同時間對張氏細胞A值的影響(n＝5,±s)

SJAMP濃度_(ρ/mg·L－1)______ _______________________________________________作用時間(t/h) 12____________________________________ _24________ 48 0 1.682±0.044 1.779±0.045 1.868±0.007 0.5 1.676±0.018 1.778±0.031 1.867±0.008 2.0 1.670±0.033 1.793±0.017 1.872±0.007 ______8.0_______1.666±0.025__1.799±0_____________________.010 1.873±0.010

表3 不同濃度SJAMP對HepG2細胞周期的影響(n＝3,χ/%,±s)

SJAMP濃度(ρ/mg·L－1)G1期S期G2期0 53.121±1.470 28.491±0.430 18.388±1.248 0.5 55.980±1.086 26.381±0.365 17.639±0.774 2.0 59.047±0.887 23.572±1.130 17.381±0.524 _____8.0______67.816±4.660_22.572±1.815________________ 12.945±3.741

表4 不同濃度SJAMP對張氏細胞周期的影響(n＝3, χ/%,±s)___________________________________________

SJAMP濃度(ρ/mg·L－1)G1期S期G2期0 59.278±2.174 26.508±2.040 14.214±1.341 0.5 59.654±0.424 25.763±0.765 14.583±1.187 2.0 56.930±0.522 26.091±1.271 16.313±1.645 _____8.0______57.877±1.541_25.073±1.591________________ 17.023±0.620

表5 不同濃度SJAMP干預后Hep G2細胞和張氏細胞PCNA的表達(n＝3,±s)_____________________________

SJAMP濃度(ρ/mg·L－1)___Hep G2細胞_____________________ _張氏細胞0 0.591±0.006 0.585±0.003 0.5 0.496±0.005 0.578±0.005 2.0 0.385±0.003 0.584±0.007 ___________8.0________________________________________________ 0.272±0.004 0.581±0.005

3 討 論

近年來,隨著人們對多糖研究的不斷深入,多糖對腫瘤的抑制作用越來越受到重視。已有研究結(jié)果顯示,云芝多糖能夠抑制結(jié)腸癌細胞的增殖[6]。我們前期研究結(jié)果已證實,SJAMP能夠抑制Hela細胞增殖[7],對DEN誘導的大鼠肝腫瘤也具有抑制作用[5]。本研究結(jié)果顯示,SJAMP作用于Hep G2細胞后對其增殖具有抑制作用,而且在一定范圍內(nèi)隨著劑量增大和作用時間延長,其抑制作用明顯增強;SJAMP不影響正常肝細胞的增殖。

真核細胞的細胞周期分為間期和分裂期(M期),間期包括G1期、S期和G2期,細胞周期大部分時間處于間期,染色體復制發(fā)生在S期(DNA合成期),G2期之后進入M期。G1期是惟一能接受外界信息刺激的時期,位于該時期的限制點是G1期～S期轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵時點,該點的轉(zhuǎn)換決定了細胞繼續(xù)增殖還是停滯或死亡[8]。有研究表明,螺旋藻多糖可抑制Hela細胞和Hep G2細胞的增殖,使細胞發(fā)生G1期阻滯[9]。我們前期研究結(jié)果也顯示, SJAMP可使Hela細胞發(fā)生G1期阻滯[1,8]。本研究結(jié)果顯示,SJAMP能夠使Hep G2細胞發(fā)生G1期阻滯,相同干預條件下,張氏細胞的細胞周期未發(fā)生顯著改變。表明SJAMP通過阻滯細胞周期,促使HepG2細胞停滯在G1期,抑制Hep G2細胞的增殖,發(fā)揮抗腫瘤的作用。

PCNA是DNA多聚酶δ的輔助蛋白,是真核細胞DNA合成過程所必需的一種核蛋白,其作用是調(diào)節(jié)DNA多聚酶的活性。已有研究表明,PCNA含量隨細胞周期的不同而變化,G1期開始增加,至S期達到高峰,G2、M期又明顯下降,G0期維持在最低水平,其變化過程與DNA的合成過程一致。目前,PCNA的表達被用來作為評價細胞增殖狀態(tài)、反映細胞增殖動力學的指標[2,8]。我們的前期研究顯示,SJAMP能夠降低Hela細胞PCNA的表達[1,8]。本文結(jié)果表明,SJAMP干預后,Hep G2細胞中PCNA的表達隨著干預劑量的增加而降低,而張氏細胞PCNA的表達則無顯著改變。本實驗中Hep G2細胞PCNA表達的變化與細胞周期的變化是一致的,表明SJAMP通過影響細胞周期而抑制Hep G2細胞的增殖。SJAMP抗腫瘤機制可能與SJAMP影響Hep G2細胞DNA合成有關(guān)。

綜上所述,SJAMP對Hep G2細胞增殖具有明顯的抑制作用,使細胞發(fā)生G1期阻滯,對正常肝細胞的增殖無抑制作用,表明SJAMP具有一定的抗肝癌作用。本文結(jié)果為SJAMP在肝癌防治中的應用提供了初步的實驗依據(jù),其確切的機制還有待于進一步深入研究。

[1]牛娟娟,宋揚.海洋刺參多糖對宮頸癌細胞周期的影響及機制[J].齊魯醫(yī)學雜志,2010,25(5):386-388.

[2]牛娟娟,宋揚.刺參黏多糖的生物活性物質(zhì)作用研究進展[J].華北煤炭醫(yī)學院學報,2009,11(5):651-652.

[3]宋迪,吉愛國,梁浩,等.刺參生物活性物質(zhì)的研究進展[J].中國生化藥物雜志,2006,27(5):316-319.

[4]蘇秀榕,婁永江,常亞青,等.海參的營養(yǎng)成分及海參多糖的抗腫瘤活性的研究[J].營養(yǎng)學報,2003,25(2):181-182.

[5]梁囡囡,宋揚,金守杰.刺參酸性黏多糖對DEN誘導肝癌形成抑制作用[J].齊魯醫(yī)學雜志,2012,27(4):316-318.

[6]周永.多糖類抗腫瘤作用的研究進展[J].國外醫(yī)學:衛(wèi)生學分冊,2001,28(3):129-132.

[7]王穎,于壯,宋揚.刺參酸性黏多糖對人宮頸癌Hela細胞caspase表達影響[J].齊魯醫(yī)學雜志,2008,23(3):191-194.

[8]張笑雪,于壯,宋揚.刺參黏多糖對Hela細胞PCNA表達及細胞周期的影響[J].山東醫(yī)藥,2008,48(46):19-21.

[9]于紅,張學成.螺旋藻多糖抗腫瘤作用的實驗研究[J].高技術(shù)通訊,2003,13(7):83-86.

(本文編輯 黃建鄉(xiāng))

EFFECT OF STICHOPUS JAPONICUS ACID MUCOPOLYSACCHARIDE ON PROLIFERATION OF LIVER CANCER CELL HepG2

JIN Yan,SONG Yang,CHEN Chen (Department of Nutrition,Qingdao University Medical College,Qingdao 266021,China)

Objective To study the effect of stichopus japonicus acid mucopolysaccharide(SJAMP)on proliferation of human liver cancer cell HepG2.MethodsHepG2 cells were cultured in vitro.MTT assay was used to observe the effect of SJAMP on proliferation of HepG2 cells.The cell cycle was measured using flow cytometry(FCM).The expression of PCNA was tested by immunocytochemistry.Normal liver cells(Zhang’s liver cells)were served as the control.ResultsSJAMP could inhibit the proliferation of HepG2 cells,its depressant effect reinforced along with the increase of intervention dose(0,0.5,2.0, 8.0 mg/L)and extension of intervention time(12,24,48 h)(F＝68.430－596.680;q＝3.714－55.029;P＜0.05);Different concentrations of SJAMP did not show apparent inhibition on proliferation of Zhang’s cells(P＜0.05).The results of cell cycle detection indicated that with the increase of SJAMP dose,the Hep G2 cells that trapped in G1 phase increased(F＝4.483－18.791;q＝1.921－9.876;P＜0.05);as for Zhang’s cells,no changes of cell cycle were noted after interfered with SJAMP(P＞0.05)Immunocytochemical technique indicated that after SJAMPintervention,the expression of PCNA in Hep G2 cells declined,the expression decreased as the dose of SJAMP increased(F＝2 688.640,q＝55.365－156.296,P＜0.05),no notable effect on the expression of Zhang’s cells was observed(P＞0.05).ConclusionSJAMP plays an anti-tumor action through inhibiting the proliferation,blocking cell cycle and decreasing expression of PCNA of Hep G2 cells.

polysaccharides;stichopus;liver neoplasms;cell proliferation

R151.3

A

1008-0341(2013)04-0299-04

10.11712/qlyx201304006

2013-02-03;

2013-05-24

國家自然基金資助項目(002-002395)

金巖(1986-),女,在讀碩士研究生。

宋揚(1968-),男,博士,教授,碩士生導師。