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(1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600;2.山東綠都安特動物藥業(yè)有限公司， 山東 濱州 256600)

示差折光檢測器(Refractive Index Detector，RID)是一種高度穩(wěn)定和靈敏的液相色譜和凝膠滲透色譜用檢測器。其原理是通過比較折光率的變化來檢測流動相中的樣品峰。對于只有紫外末端吸收的物質(zhì)，用紫外檢測時靈敏度相對較低，同時易發(fā)生基線漂移，而用示差折光檢測器時可取得較為理想的結(jié)果，如聚合物、糖、有機酸等。目前HPLC-RID檢測物質(zhì)含量多應用于醫(yī)藥及食品行業(yè)，本文就示差折光檢測器在藥物含量檢測方面的應用進行綜述，以利于示差折光檢測技術(shù)的更廣泛應用奠定基礎。

1 皂苷元含量測定

傳統(tǒng)的皂苷元含量測定多采用薄板層析配合薄板掃描方法或比色法。前者無法分離某些結(jié)構(gòu)相似的皂苷元成分，難以做到對單一組分的定性、定量測定，后者也只能對總皂苷元的相對含量進行測定，應用中受到較大限制。高效液相色譜配示差折光檢測器作為近年來發(fā)展起來的研究方法，具有高效率、高精密度、高靈敏度等優(yōu)點，已經(jīng)在各領(lǐng)域得到了廣泛的應用。

采用反相高效液相色譜配示差折光檢測器(Reversed Phase High Performance Liquid Chromatography，RP-HPLC-RID)法對知母不同炮制品中薩爾薩皂苷元進行分離分析,樣品用乙醇提取后采用氯仿進行萃取，發(fā)現(xiàn)生品、清炒、鹽炙、酒炙及麩炒品中薩爾薩皂苷元含量分別為1.219%、1.344%、1.772%、1.275%和1.519%。采用RP-HPLC-RID法建立了復方知母膠囊中菝葜皂苷元的含量測定方法。當以純甲醇為流動相，被測定峰與雜質(zhì)峰分離度良好，線性范圍為1.0～7.0 μg，平均回收率98.66%。采用RP-HPLC，利用C18柱和RID比較了蒺藜全草和果實中主要甾體皂苷元的含量差異,證實全草與果實中的?？稍碥赵肯嘟娓嬖碥赵坑袠O顯著差異(P<0.01)，從而確定替告皂苷是蒺藜全草的主要指標成分。

2 內(nèi)酯含量測定

銀杏中含有豐富的黃酮類成分，另有萜類、酚類以及多種微量元素、維生素和氨基酸等，在防治心血管病、抗老防衰、保護肌膚、抗癌、抗菌、抗過敏有很好的療效。其中含有的黃酮類和內(nèi)酯類成分均有較強的紫外吸收，且黃酮類紫外吸收大于內(nèi)酯類，因此，測定其中的內(nèi)酯類成分時，多運用RID方法，其原理系利用樣品與流動相折光率不用而檢測樣品，具有通用性強、操作簡便及對黃酮類響應低等優(yōu)點。王淑君等[1]測定了銀杏葉緩釋膠囊中銀杏內(nèi)酯的含量，白果內(nèi)酯及銀杏內(nèi)酯A、B、C在10～80 mg/L濃度范圍內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系，獲得了較高的靈敏度。采用HPLC-RID測定銀杏總內(nèi)酯注射液中銀杏總內(nèi)酯的含量，以Dikama Diamosil C18為色譜柱，流動相為甲醇-水(35:6),表明白果內(nèi)酯在0.206～2.060 mg/mL、銀杏內(nèi)酯A在0.150～1.500 mg/mL、銀杏內(nèi)酯B在0.102～1.020 mg/mL、銀杏內(nèi)酯C在0.056～0.560 mg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。同時該方法具有操作簡便，靈敏度高，重復性好等優(yōu)點。商軍等[2]采用HPLC-RID法對天然甜菜堿(三甲胺乙內(nèi)酯)的含量進行測定，在2.005～10.026 mg/mL濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，回收率達98.8%，與GB/T 2515-2008《飼料添加劑天然甜菜堿》中的離子色譜和高氯酸滴定方法相比，該方法具有快速、簡便、適用性強等優(yōu)點，適用于飼料添加劑中天然甜菜堿的含量測定。

3 糖類成分含量測定

3.1 單糖含量測定

柯云翠等[3]以鈣型強酸性陽離子交換樹脂為固定相，采用HPLC-RID對復方甘露醇注射液中甘露醇和葡萄糖的含量進行檢測，甘露醇在0.15～15 mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，平均回收率為100.1%；葡萄糖在0.05～5 mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，平均回收率100.1%。周禮玲等[4]建立了HPLC-RID法同時測定替硝唑與葡萄糖含量的方法。該方法采用氨基鍵合硅膠色譜柱，替硝唑和葡萄糖分別在0.10～0.50 g/L和1.25～6.25 g/L濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，平均回收率為100.3%和99.8%，測定結(jié)果與藥典方法一致，但可省去藥典中兩種物質(zhì)分別測定的繁瑣，可以簡便、快速、準確的測定樣品的含量，有利于藥品的快速檢測。

3.2 寡糖含量測定

邱建國等[5]建立了地黃寡糖簡便有效穩(wěn)定的測定方法。采用NH2-C18色譜柱分離，示差折光檢測器檢測測定地黃中寡糖。結(jié)果表明，水蘇糖在0.0978～0.3260 mg時呈良好的線性關(guān)系，回收率達99.43%。采用RP-HPLC-RID建立了保健品中蔗糖、棉子糖和水蘇糖的含量測定方法，以Zorbax NH2為色譜柱，蔗糖、棉子糖和水蘇糖的線性范圍分別為2.38～23.8、2.04～20.4、2.24～22.4 μg/mL，加樣回收率分別為96.4%、97.5%和97.4%。邱建國等[6]考察河南新鄉(xiāng)、西峽、三門峽、溫縣、淮陽以及甘肅慶陽、清水、金崖、大康營等地的生地黃中所含地黃寡糖和梓醇的含量。采用水為溶媒，超聲提取糖類成分，NH2色譜柱分離，示差折光檢測器檢測測定；采用甲醇為溶媒，超聲提取梓醇，C18色譜柱分離，210 nm處測定紫外吸收值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)地生地黃中梓醇成分的含量差異則不是很大，其中甘肅產(chǎn)地的相對較高。水蘇糖量最高，產(chǎn)地不同，有所差異，所有產(chǎn)地均含有棉子糖，量相對較高，水蘇糖與棉子糖含量呈正比關(guān)系，各地甘露三糖含量較低，部分地區(qū)生地中甚至無甘露三糖。該結(jié)論進行的HPLC法測定地黃及含地黃成藥中寡糖所得結(jié)論一致。邱建國等[7]采用NH2-硅膠色譜柱分離考察了河南新鄉(xiāng)、西峽、三門峽、溫縣、淮陽以及甘肅慶陽、清水、金崖、大康營等地的生地及炮制所得熟地中含地黃寡糖的量，以棉子糖、甘露三糖和水蘇糖為考核指標。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，生地黃中水蘇糖量最高，產(chǎn)地不同，有所差異，所有產(chǎn)地均含有棉子糖，量相對較高，水蘇糖與棉子糖含量呈正比關(guān)系，而各地甘露三糖含量較低，部分地區(qū)生地中甚至無甘露三糖。

3.3 多糖成分及含量測定

田艷玲等[8]采用示差折光分析法測定飲料中果糖、葡萄糖、蔗糖含量。色譜柱為AgilentCar-bohydrate，流動相為乙腈-水(75:25)。該方法的檢出率0.5%，加標回收率92.0%～110.0%，相對標準偏差為4.13%。歐陽華學等[9]采用示差折光法建立了同時測定枸杞中單糖和低聚糖的方法。鼠李糖、果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖在10.0～400.0 mg/L范圍內(nèi)，質(zhì)量濃度與色譜峰面積呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r=0.9976～0.9998。精密度RSD分別為2.15%、1.49%、1.09%、3.82%、4.65%，加標回收率為92.27%～101.93%，該方法的檢出限分別達到4 mg/kg、5 mg/kg、4 mg/kg、6 mg/kg、5 mg/kg。梁蔚陽等[10]建立同時測定注射用轉(zhuǎn)化糖中果糖與葡萄糖含量的高效液相色譜示差折光檢測法。采用氨基鍵合硅膠柱(250 mm,4.6 mm,5 m)，流動相為乙腈-水(85:15)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，果糖和葡萄糖分別在0.1266～0.8861 mg和0.1263～0.8842 mg濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，回收率分別為99.8%和99.7%。顏軍等[11]建立了用示差折光高效液相色譜法測定復方胃蛋白酶顆粒中葡萄糖、蔗糖、麥芽糖含量的方法。選用色譜柱為Sugar-D，流動相為乙腈-水(78:22，V/V)。結(jié)果表明，葡萄糖、蔗糖、麥芽糖能較好分離，在0.50～10.00 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；葡萄糖回收率為94.3%～103.7%，蔗糖回收率為101.4%～105.1%；經(jīng)不確定度評價合成不確定度為1.92%，擴展不確定度為4.1%。該方法簡單、準確、穩(wěn)定、可靠，可用于復方胃蛋白酶顆粒中葡萄糖、蔗糖的含量測定。張進杰等[12]以市售淡水魚為試材，建立水產(chǎn)品中還原糖(葡萄糖、核糖)、磷酸化糖(磷酸化核糖和磷酸化葡萄糖)和蔗糖的定性、定量檢測方法。用乙醇/水提取魚肉中各糖物質(zhì)，經(jīng)樹脂吸附處理后，對魚肉中各糖物質(zhì)進行分析。結(jié)果顯示，各糖物質(zhì)分離效果較好，各物質(zhì)線性關(guān)系良好，回收率在70.2%～98.5%之間，重復性RSD均小于5%。劉瀟瀟等[13]采用HPLC-RID法建立了同時測定參芪扶正注射液中葡萄糖、果糖和蔗糖含量的方法。果糖、葡萄糖和蔗糖進樣量分別在19.1～127.3(r=0.9998)、15.9～106.5(r=0.9996)和6.5～43.5 μg(r=0.9996)范圍內(nèi)與其峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系；平均加樣回收率分別為97.3%、99.2%和95.6%，RSD分別為4.2%、4.4%、5.2%，操作簡便，可用于參芪扶正注射液的質(zhì)量控制。劉泰然等[14]將保健食品經(jīng)水提取，在沸水浴中用硫酸水解，用氫氧化鈉調(diào)成中性后以乙腈+水(70:30)為流動相，通過氨基柱分離后用示差折光檢測器檢測，同一樣品在水解前后木糖含量的差值即為樣品中低聚木糖的含量。木糖濃度在0.30～4.50 mg/mL濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，相對標準偏差1.86%～3.80%。

銀杏外種皮多糖(Ginkgobilobaexocarppolysac-charides, GBEP)是從銀杏種實的外種皮中提取制得的，具有抗腫瘤及增強機體免疫功能等生物學活性。其中含有蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)部分，還含有少量單糖，而單糖在紫外檢測器中幾乎無吸收峰，多糖的吸收峰也很小，而在示差折光檢測器中能有效地將各種組分分離。魯萍等[15]采用示差折光檢測器測定銀杏外種皮多糖的分子質(zhì)量及含量，以葡聚糖為標樣，PLaquagel-OHMIXED(7.5 mm×300 mm,8 μm)為色譜柱，發(fā)現(xiàn)銀杏外種皮多糖的分子質(zhì)量為11062.5，RSD為0.78%(n=6)；含量為68.7%，RSD為3.4%(n=6)，葡聚糖(分子質(zhì)量為12000)在1～20 μg呈良好線性關(guān)系(r=0.9999)，平均加樣回收率為97.9%，RSD為2.5%。郭守軍等[16]利用配示差折光檢測器的高效液相色譜外標法直接分離分析半乳甘露聚糖膠中單糖的組成，木糖、葡萄糖、半乳糖和甘露糖的分離可在20 min內(nèi)完成，檢測限分別為2.0 μg、20 μg、1.0 μg和20 μg，線性范圍為2～10 mg/mL。

4 其他藥物成分測定

張佩軍等[17]用高效液相色譜法測定了霍膽丸的含量，豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸在20～99.96 μg范圍內(nèi)，峰面積與進樣量呈良好的線性關(guān)系，甲氧回收率分別為99.58%和99.39%。池玉梅等[18]采用示差折光檢測器檢測黃芪及黃芪精口服液中黃芪甲苷的含量，在1～5 μg范圍內(nèi)，結(jié)果均呈良好的線性關(guān)系，加樣回收率分別為98.3%和98.1%。與紫外檢測法相比較，該方法靈敏度更高，同時消除了紫外檢測法由于黃芪甲苷的檢測波長在末端吸收而存在的干擾大的問題。顧振宇等[19]用甲醇超聲提取蟲草素、水超聲提取蟲草酸，再用高效液相色譜、示差折光檢測器與紫外檢測器串聯(lián)的方法測定蟲草素和蟲草酸含量。二者檢出限分別為50 ng/mL和1.5 μg/mL，回收率在90%～101%之間。

5 展 望

隨著人們對食品安全問題的日益重視，中藥在獸醫(yī)臨床獲得了廣泛應用，但目前大部分成分尚無含量測定方法。作為一種高度穩(wěn)定、靈敏的通用型檢測器，示差折光檢測器具有廣泛的使用范圍，可彌補紫外檢測器的不足，在聚合物、糖類、有機酸、甘油三酸酯、高分子化合物、脂肪烷烴等物質(zhì)測定方面具有獨特的優(yōu)勢，已成為一種重要的分離分析技術(shù)，在畜牧獸醫(yī)領(lǐng)域具有廣闊的發(fā)展前景。

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