吳小秋，劉志龍

(1.廣東省中醫(yī)院珠海醫(yī)院，廣州中醫(yī)藥大學，廣東 珠海 519000;2.珠海市第二人民醫(yī)院，廣東 珠海 519000)

中醫(yī)證候的系統(tǒng)生物學研究

吳小秋1，劉志龍2*

(1.廣東省中醫(yī)院珠海醫(yī)院，廣州中醫(yī)藥大學，廣東 珠海 519000;2.珠海市第二人民醫(yī)院，廣東 珠海 519000)

系統(tǒng)生物學方法的運用為中醫(yī)證候研究注入新的活力，有望揭示中醫(yī)證候的本質(zhì)及實現(xiàn)中醫(yī)證候的客觀化。系統(tǒng)生物學的研究內(nèi)容主要包括功能基因組學、蛋白質(zhì)組學和代謝組學的各個層面，是研究生命活動最有效和全面的方法，所以從系統(tǒng)生物學角度出發(fā)，探索疾病的中醫(yī)證候不僅成為可能，而且也具有重要的現(xiàn)實意義。常見疾病如冠心病、急性腦卒中、高血壓病等的中醫(yī)證候系統(tǒng)生物學研究取得了一定的進展，為今后的研究提供了思路與方法指導。

中醫(yī)證候；系統(tǒng)生物學；冠心??；腦卒中；高血壓??；還原論；生命現(xiàn)象；生物本質(zhì)

證候研究是近年來中醫(yī)界研究的熱點之一。從既往的還原分析方法到現(xiàn)在的系統(tǒng)生物學方法，均做了大量的臨床工作，取得一定成績。針對目前證候研究的熱點，現(xiàn)從系統(tǒng)生物學角度對近年在該領域中的研究做以下總結(jié)。

1 中醫(yī)證候的概念

在1986年“中醫(yī)證候規(guī)范”研究第二次會議上提出了中醫(yī)證候的概念：證候是疾病發(fā)生和演變過程中某階段本質(zhì)的反映，它以某些相關(guān)的脈癥，不同程度地揭示病因、病機、病位、病性、病勢等，為論治提供依據(jù)。[1]2004年結(jié)題的科技部基礎性工作項目“中醫(yī)藥基本名詞規(guī)范化研究”課題組給出的證的概念為：證是對疾病中一定階段的病位、病性、病勢及機體抗病能力的強弱等本質(zhì)的概括。[2]雖然表述各異，所述內(nèi)容基本一致，即證候反應疾病的本質(zhì)。

2 系統(tǒng)生物學的概念

系統(tǒng)生物學是一門研究生物系統(tǒng)中所有組成單元(DNA、RNA、蛋白質(zhì)、代謝物小分子等)的構(gòu)成以及在特定條件下，如遺傳的、環(huán)境的因素變化時，分析這些組分間相互作用和調(diào)控的學科。[3]和以往分子生物學研究單個基因或者蛋白質(zhì)不同，系統(tǒng)生物學研究的是生物單元在所有水平上復雜的相互作用，重點考查這些生物單元整合一起的方式，即分散的生物單元如何形成了系統(tǒng)整體的功能和機制。在對生物系統(tǒng)有了整體把握的基礎上，系統(tǒng)生物學可以比較全面地解析生命運動的全過程，利用系統(tǒng)的思維方式、復雜性科學的理論以及整體性研究的手段來揭示生命現(xiàn)象的一些基本原理和本質(zhì)規(guī)律。[4-6]

系統(tǒng)生物學的主要特點有:1)整合：指系統(tǒng)內(nèi)不同構(gòu)成要素(基因、蛋白質(zhì)、生物小分子等)的整合，從基因到細胞、到組織、到個體的各個層次的整合；2)信息:生命系統(tǒng)的信息流向是DNA→mRNA→蛋白質(zhì)→蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡→細胞→組織/器官→個體,系統(tǒng)生物學的重要任務就是要盡可能地獲得每個層次的信息并將它們進行整合；3)干涉：系統(tǒng)生物學一方面要了解系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)組成，另一方面要揭示系統(tǒng)的行為方式。也就是說，系統(tǒng)生物學研究的并非是一種靜態(tài)的結(jié)構(gòu)，而是要在人為控制的狀態(tài)下，揭示出特定的生命系統(tǒng)在不同的條件下和不同的時間段具有什么樣的動力學特征。[6-7]

3 中醫(yī)證候與系統(tǒng)生物學的關(guān)系

中醫(yī)證候是一個復雜生命現(xiàn)象的外在表現(xiàn)，這些生命現(xiàn)象包括生理、病理、生化、基因、蛋白、代謝等多方面。在既往研究中，側(cè)重于運用還原論的思維方法研究中醫(yī)證候，這與中醫(yī)證候的本質(zhì)不十分吻合。而系統(tǒng)生物學研究方法的引入，為中醫(yī)證候本質(zhì)研究開辟了新的思路。從中醫(yī)證候與系統(tǒng)生物學的概念來看，兩者有著共同之處，均是揭示生命現(xiàn)象的本質(zhì)。只是,中醫(yī)證候?qū)儆诔橄蟾拍頪8]，但如何把這抽象的概念用現(xiàn)代醫(yī)學所證實顯得尤為重要；而系統(tǒng)生物學正是研究所有組成單元(DNA、RNA、蛋白質(zhì)、代謝物小分子等)的構(gòu)成及其相互作用的學科,這與中醫(yī)學整體觀念的特點不謀而合。[6,9-10]因此，利用系統(tǒng)生物學研究證候的生物學基礎是可行的，系統(tǒng)生物學無疑給中醫(yī)證候?qū)W客觀化和現(xiàn)代化的要求提供了理論上的可能。[11]

4 常見疾病的中醫(yī)證候系統(tǒng)生物學研究

針對數(shù)年前中醫(yī)證候研究的瓶頸，近年來系統(tǒng)生物學概念的指出及在醫(yī)學領域研究中的應用，為中醫(yī)證候的研究找到了新的方法，也為中醫(yī)客觀化提供了新的思路。

系統(tǒng)生物學的研究內(nèi)容主要包括功能基因組學、蛋白質(zhì)組學和代謝組學的各個層面，是研究生命活動最有效和全面的方法，所以從系統(tǒng)生物學角度出發(fā)，探索疾病的中醫(yī)證候不僅成為可能，也具有重要的現(xiàn)實意義。[12]

4.1 冠心病的系統(tǒng)生物學研究 冠心病屬中醫(yī)胸痹、心痛范疇，主要證候類型有氣虛痰瘀、血瘀等。在冠心病的中醫(yī)證候研究中，運用系統(tǒng)生物學技術(shù)研究冠心病的各個證候取得了初步的成績。如在冠心病心氣虛證的研究中發(fā)現(xiàn)，RyR2基因表達變化情況可進一步揭示冠心病心氣虛證的證候?qū)嵸|(zhì)，RyR2功能失調(diào)可導致心功能下降。與中醫(yī)學心主血脈，心氣是推動血液運行的基本動力，心氣虧虛導致心功能減退相吻合。[13]

在痰濁內(nèi)阻及心氣虛弱型冠心病患者的蛋白質(zhì)組學研究中發(fā)現(xiàn)，載脂蛋白H、補體成分C3、血紅素結(jié)合蛋白、載脂蛋白E等12種差異表達蛋白均在痰濁內(nèi)阻證患者體內(nèi)高表達，而在這12種差異表達蛋白中，載脂蛋白E、載脂蛋白H表達水平具有明顯差異，且與脂代謝均有比較重要的關(guān)系，這為臨床辨證痰濁內(nèi)阻及心氣虛弱型冠心病提供了微觀依據(jù)[14]。在冠心病心氣虛弱證/心腎陰虛證的血清蛋白質(zhì)組學研究中發(fā)現(xiàn)的差異蛋白有凝血酶原、載脂蛋白A1、載脂蛋白E、載脂蛋白H、活化T細胞核因子5亞型b等，且這些差異蛋白與不同證候的形成有關(guān)，有望作為證候?qū)嵸|(zhì)的標志性蛋白。[15]

在冠心病血瘀證的代謝組學研究中，采用磁共振和模式識別技術(shù)對磁共振氫譜進行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血瘀證患者尿液中脯氨酸、丙氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、組氨酸、馬尿酸等物質(zhì)的含量升高。檸檬酸、肌酸酐、牛磺酸等物質(zhì)的含量下降，與健康人在代謝組學方面存在差異，表明尿液樣品中檸檬酸、脯氨酸、異亮氨酸、?；撬岬却x物的改變構(gòu)成了冠心病不穩(wěn)定性心絞痛血瘀證患者的代謝組學特征。[16]而在冠心病辨證為痰阻心脈、氣陰兩虛、氣虛血瘀及氣滯血瘀4型的代謝組學研究中發(fā)現(xiàn)，通過運用代謝組學技術(shù)可能明顯對以上證型進行辨別、區(qū)分，是辨證的客觀化探討。[17-18]

4.2 急性腦卒中的系統(tǒng)生物學研究 急性腦卒中歸屬于缺血性中風范疇，主要由氣血逆亂引起，常與風、火、痰、瘀、虛等相關(guān)。本病的系統(tǒng)生物學研究也對其常見證候類型作出了初步的探討。如在對缺血性中風血瘀證的基因表達方面發(fā)現(xiàn),AT1R基因1166AC、eNOS基因298AspAsp基因型是缺血性中風病血瘀證發(fā)生的危險因素，為缺血性中風血瘀證提供了微觀辨證基礎。[19]

在缺血性中風蛋白質(zhì)組學的實驗研究方面發(fā)現(xiàn)，腦缺血6h后和缺血24h后有不同的差異蛋白。腦缺血6h后，缺血模型和缺血對照之間有31個蛋白差異點，其中5個蛋白表達上調(diào)，26個蛋白表達下調(diào)，質(zhì)譜鑒定出的6種蛋白質(zhì)有14-3-3ζ轉(zhuǎn)錄本、B型肌酸激酶、異檸檬酸脫氫酶α亞基、蛋白酶體β亞基、絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酯酶2A催化亞基β轉(zhuǎn)錄本、α微管蛋白；腦缺血24h后,缺血模型和缺血對照之間有18個蛋白差異點，其中5個蛋白表達量上升，13個蛋白表達量下降，質(zhì)譜鑒定出的6種蛋白有14-3-3ζ轉(zhuǎn)錄本、B型肌酸激酶、磷酸蛋白質(zhì)磷酸酯酶1、ATP合成酶β鏈、α烯醇化酶和α微管蛋白；2個缺血時間點有3個差異表達蛋白為相同的蛋白質(zhì),即14-3-3ζ轉(zhuǎn)錄本、B型肌酸激酶和α微管蛋白。[20]

而在缺血性中風代謝組學的實驗研究中發(fā)現(xiàn)，缺血性中風模型大鼠血漿中的丙酮酸、?；撬?、羥脯氨酸的含量明顯升高，而乳酸、甘油酸、氨基丙二酸、果糖、色氨酸和亮氨酸顯著下降，提示血漿中這9種內(nèi)源性物質(zhì)為腦缺血的潛在生物標志物，且通過藥物干預后這9種代謝產(chǎn)物可不同程度的改善。[21]

4.3 高血壓病的系統(tǒng)生物學研究 高血壓病常與中醫(yī)的眩暈病相對應，發(fā)病機制常與風、火、痰、虛、瘀相關(guān)。在高血壓的基因組學研究中，唐靖一等[22]將高血壓病患者辨證分型為肝火亢盛型、陰虛陽亢型、痰濕壅盛型、陰陽兩虛型,分析不同中醫(yī)證型與COX-2基因表達的相關(guān)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，COX-765G/C基因在實驗組與正常對照組的分布存在差異；COX-1195G/A基因多態(tài)性與高血壓肝火亢盛證、陰虛陽亢證的發(fā)生有相關(guān)性,與虛證(陰虛陽亢+陰陽兩虛)比較，實證(肝火亢盛+痰濕壅盛)GG、CG+CC基因型頻率明顯增高。提示COX-1195G/A基因變異可能是高血壓肝火亢盛證、陰虛陽亢證發(fā)生過程的重要遺傳因素，-765G/C位點GG、CG+CC基因頻率可能與高血壓病虛實辨證相關(guān)。而董呂武等[23]則發(fā)現(xiàn)，高血壓患者ACE基因DD型在陰虛陽亢組與正常對照組之間顯著差異,提示原發(fā)性高血壓陰虛陽亢型可能與ACE基因DD型有關(guān)聯(lián)。

在高血壓病的蛋白質(zhì)組學研究中發(fā)現(xiàn)，高血壓病肝膽濕熱證與對照組之間共檢測出有顯著差異的蛋白質(zhì)峰182個,高血壓病肝膽濕熱證與高血壓病非肝膽濕熱組之間共檢測出有顯著差異的蛋白質(zhì)峰132個,提示差異表達的蛋白質(zhì)是高血壓病肝膽濕熱證的物質(zhì)基礎。[24]而其在對高血壓病痰濕壅盛證患者血清蛋白質(zhì)組學的研究中發(fā)現(xiàn)，高血壓病痰濕壅盛證(痰濕壅盛)與對照組之間共檢測出有顯著差異的蛋白質(zhì)峰102個,以質(zhì)荷比為9334.958(表達增高)、9280.191(表達降低)、8030.794(表達增高)和2941.551(表達增高)4個蛋白峰組成的診斷模型能很好地將痰濕壅盛區(qū)分出來。提示篩選出的差異蛋白質(zhì)是該證型患者血清蛋白標記物中區(qū)別于正常人和非此證型的高血壓患者的共性特異蛋白，此研究為中醫(yī)辨證提供了一種更加客觀準確的辨證手段。[25]

在高血壓病的代謝組學研究方面發(fā)現(xiàn)，高血壓病肝陽上亢證患者的尿液代謝物與正常組比較，患者組機體相關(guān)代謝發(fā)生顯著變化，主要代謝物包括氨基酸、游離脂肪酸、神經(jīng)鞘氨醇等。此研究從微觀領域?qū)ふ倚》肿哟x標記物，有利于深入發(fā)現(xiàn)中醫(yī)證候的生物學本質(zhì)[26]。

在臨床其他疾病如糖尿病、陽痿、慢性腎炎患者中典型腎陽虛證病例的轉(zhuǎn)錄組學的特征研究中發(fā)現(xiàn)332條共同差異表達基因,且腎陽虛與免疫系統(tǒng)、氨基酸分解和合成、脂類代謝、生殖、能量代謝及腫瘤相關(guān)的基因有密切聯(lián)系且促使其代謝功能降低[27]。另外，在慢性乙型病毒性肝炎中醫(yī)虛證的蛋白質(zhì)組學研究[28]、腎虛痰瘀型2型糖尿病患者血清代謝組學研究[29]等研究中均作了大量的工作。但是中醫(yī)證候復雜，證候類型多樣，且存在異病同證、同病異證，因此如何運用系統(tǒng)生物學研究各個疾病的各個證候類型以及不同疾病相同證候類型、或相同疾病不同證候類型的組學研究及對比分析顯得任重道遠。

5 小結(jié)

近年來，中醫(yī)證候研究處于瓶頸期，且經(jīng)過數(shù)年的研究尚未取得根本性的突破。而系統(tǒng)生物學方法的引入為中醫(yī)證候研究注入新的活力。生物機體是一個整體化和網(wǎng)絡化的復雜體系，在基因-蛋白-代謝終產(chǎn)物這樣一個生物信息傳遞鏈中，機體需通過不斷調(diào)整復雜的代謝網(wǎng)絡來維持自身與外界的互動平衡?；蚝偷鞍踪|(zhì)的變化告訴我們生命體可能會發(fā)生什么，而代謝物質(zhì)和代謝表型所反映的是已經(jīng)發(fā)生了什么，直接體現(xiàn)生物體系生理和生化功能狀態(tài)。[11]而中醫(yī)學正是研究整個生物體的外在反應。系統(tǒng)生物學方法的應用與中醫(yī)學證候研究不謀而合。通過系統(tǒng)生物學對生物本質(zhì)的探討和理解，人們對生物的認識也經(jīng)歷了由現(xiàn)象到本質(zhì)、由表及里的過程。[30]但是就目前研究現(xiàn)狀提示，系統(tǒng)生物學在中醫(yī)證候中的研究尚屬起步階段，尚未全面開展，且系統(tǒng)生物學研究對技術(shù)力量、方法、設備等均要求很高，限制了其全面應用。另外，因研究尚剛開始，病例數(shù)較少，且代謝產(chǎn)物多種多樣，較難篩選到真正意義的代謝產(chǎn)物。而目前組學研究的結(jié)果真正應用于臨床較少，尚在初始探討中。

雖有目前研究中的問題，但系統(tǒng)生物學研究方法正廣泛應用于中醫(yī)證候研究，且系統(tǒng)生物學中代謝組學技術(shù)的應用更為受人關(guān)注。采用代謝組學相關(guān)技術(shù)與方法進行中醫(yī)證候研究，有望在中醫(yī)藥領域取得突破性進展。[31]因此，在加強各技術(shù)力量、提供技術(shù)平臺的同時，擴大臨床研究的樣本量及臨床對比分析，必要時進行隨機雙盲對照實驗，結(jié)合中醫(yī)基礎理論，充分運用系統(tǒng)生物學技術(shù)廣泛深入地開展證候研究，對揭示中醫(yī)證候本質(zhì)具有十分重要的意義。

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R2-03

A

1003-5699(2013)01-0012-04

2012-09-24)

珠海市衛(wèi)生局2011年立項課題(編號：2011063)。

吳小秋(1979-),男,博士研究生,主治醫(yī)師。研究方向:中醫(yī)藥防治內(nèi)分泌疾病。

*通信作者:劉志龍,Tel:18926996118,E-mail:zhlzl6118@163.com