孟 茹， 趙貴明， 賈 瑜， 王振寶

（1.伊犁出入境檢驗(yàn)檢疫局，新疆 伊寧 835000；2.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京 100013；3.北京勤邦生物技術(shù)有限公司，北京 102206）

乳酸鏈球菌素[1]（英文名Nisin，以下簡(jiǎn)稱Nisin）又稱乳鏈菌肽，是一種高分子多肽，分子式為C143H228N42O37S7。它是從乳酸乳球菌或乳酸鏈球菌發(fā)酵產(chǎn)物中提制的一種多肽抗菌素類物質(zhì)，被認(rèn)為是一種高效、天然生物性食品防腐劑和抗菌劑，能有效殺死或抑制引起食品腐敗變質(zhì)的革蘭氏陽(yáng)性菌，特別是細(xì)菌孢子，如葡萄球菌、鏈球菌、乳桿菌、小球菌、明串珠菌、芽孢桿菌等。到目前為止，全世界約有50多個(gè)國(guó)家和地區(qū)廣泛使用Nisin[2]，我國(guó)于1990年開(kāi)始批準(zhǔn)使用Nisin，并在 《GB 2760-2010食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定Nisin作為食品防腐劑的最大允許使用量。

Nisin定量分析的最初測(cè)定方法為甲基藍(lán)還原法[3]，后來(lái)相繼開(kāi)發(fā)了用于Nisin定量的生物分析方法，包括試管稀釋法、濁度分析法[4]、瓊脂擴(kuò)散法[5-7]、ATP生物發(fā)光測(cè)定法[8-9]、綠光熒光蛋白測(cè)定法和微量滴定法等。國(guó)外于1990年開(kāi)始報(bào)道Nisin的酶聯(lián)免疫分析法，F(xiàn)alahee[10]發(fā)展了多克隆抗血清分析乳酸鏈球菌素的酶聯(lián)免疫分析法，該方法對(duì)奶酪中Nisin的最低檢測(cè)質(zhì)量濃度為200 ug/mL。Suacrez[11]設(shè)計(jì)的多克隆抗體酶聯(lián)免疫吸附法在牛奶和乳清中的最低檢測(cè)質(zhì)量濃度為170 ug/mL。作者從制備Nisin多克隆抗體、優(yōu)化反應(yīng)模式出發(fā)，建立了乳制品及肉制品中Nisin間接競(jìng)爭(zhēng)性ELISA定量檢測(cè)方法并制備了相應(yīng)的試劑盒，擴(kuò)大了檢測(cè)對(duì)象范圍，具備穩(wěn)定性好，檢測(cè)限低的特點(diǎn)，并填補(bǔ)了國(guó)內(nèi)乳酸鏈球菌素酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒的空白。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 新西蘭大白兔，購(gòu)自興隆實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖廠。

1.1.2 試劑 Nisin標(biāo)準(zhǔn)品，牛血清白蛋白（BSA），卵清蛋白（OVA），美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；羊抗兔酶標(biāo)記二抗，北京金橋凱泰生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；TMB底物顯色液，弗氏完全佐劑（羊毛脂、液體石蠟，自配），弗氏不完全佐劑（羊毛脂、液體石蠟和卡介苗，自配），其他常規(guī)化學(xué)試劑，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 設(shè)備 MK3型酶標(biāo)儀，芬蘭雷伯公司產(chǎn)品；微量移液器，Eppendorf公司產(chǎn)品；BF400型恒溫培養(yǎng)箱，德國(guó)賓得公司產(chǎn)品；MK3型漩渦混合器，德國(guó)IKA公司產(chǎn)品；MS1602S型電子天平，梅特勒·托利多公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 免疫原的制備 采用碳二亞胺法[12]將Nisin標(biāo)準(zhǔn)品分別與BSA和OVA偶聯(lián)制備偶聯(lián)物，分別作為免疫原和包被原。

1.2.2 多克隆抗體的制備

1）動(dòng)物免疫

由于Nisin的分子量為3 510 Da，而其活性分別以二聚體和四聚體形式出現(xiàn)，其二聚體和四聚體的分子量分別為7 000 Da和14 000 Da[13-14]，介于小分子和大分子之間，故用Nisin的標(biāo)準(zhǔn)品以及其與BSA的偶聯(lián)物分別作為免疫原進(jìn)行免疫。

取1.0 μg/mL的免疫原溶液用于免疫新西蘭大白兔。首次免疫時(shí)，將免疫原與等量的弗氏佐劑混勻，每只兔子2.0 mL，頸背部皮下多點(diǎn)注射，每點(diǎn)0.2 mL，第二次免疫時(shí)取免疫原與等量的弗氏不完全佐劑混勻，每只兔子2.0 mL，頸背部皮下多點(diǎn)注射，每點(diǎn)0.2 mL。每次注射間隔2周，從第三次免疫開(kāi)始，每次免疫后一周采血檢測(cè)抗血清效價(jià)，連續(xù)加強(qiáng)免疫，直到獲得滿意的抗體效價(jià)為止。最后一次無(wú)佐劑用1.0 mg抗原直接腹腔注射。

2）抗血清的采集

將兔子全身麻醉后實(shí)施心臟穿刺取血。將采得的血液室溫靜置2～3 h，4℃過(guò)夜后低速離心30 min分離血清，收集上清液，分裝，-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

3）抗血清的純化

采用辛酸-硫酸銨法[15-16]純化制得的多克隆抗體，用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定其在280、260 nm的吸光度值，計(jì)算蛋白質(zhì)含量[17]。

1.2.3 ELISA方法的建立

1）酶標(biāo)板包被抗原的選擇

將Nisin-OVA偶聯(lián)物及Nisin分別稀釋至相同的濃度，包板后采用間接競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)。

2）最佳抗原抗體稀釋質(zhì)量濃度配比的確定

將上步選定好的抗原和抗體分別梯度稀釋后，帶2.5 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)，確定抗原抗體的最佳稀釋倍數(shù)。

3）標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)，將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋為 0.1、0.5、2.5、12.5、62.5 μg/mL 作為標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)，各取 50 μL 加入已包被有抗原的酶標(biāo)板孔，然后加入50 μL按最佳稀釋倍數(shù)稀釋的抗體溶液，置于37℃避光反應(yīng)30 min，取出洗板4～5次。每孔加入已經(jīng)稀釋好的酶標(biāo)抗體100 μL，37 ℃避光反應(yīng) 30 min，取出洗板 4～5 次。加入底物顯色液100 μL后，37℃避光反應(yīng)15 min，用酶標(biāo)儀在450/630 nm處測(cè)定波長(zhǎng)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

4）樣品處理方法的選擇

將肉制品剁碎成粉末狀后取樣，用稀釋液稀釋不同的倍數(shù)；含乳飲料直接稀釋不同的倍數(shù)后分別進(jìn)行直接檢測(cè)和添加標(biāo)準(zhǔn)品后測(cè)定回收率。選擇樣本檢測(cè)值穩(wěn)定、添加回收率準(zhǔn)確的樣本處理方法。

1.2.4 ELISA方法的評(píng)價(jià)

1）方法的靈敏度

評(píng)價(jià)競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法靈敏度的指標(biāo)，常用的有IC50抑制濃度 （指0標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度值的50%處所對(duì)應(yīng)的標(biāo)品濃度）和最低檢測(cè)限，兩者值越低說(shuō)明試劑盒的靈敏度越高。一般規(guī)定20份空白樣品或零標(biāo)準(zhǔn)品的測(cè)定平均值加3倍標(biāo)準(zhǔn)差為方法的最低檢測(cè)限。分別測(cè)定20次標(biāo)準(zhǔn)曲線的IC50抑制濃度，確定該值浮動(dòng)范圍。分別測(cè)定20份空白含乳飲料和肉制品，求其對(duì)應(yīng)的最低檢測(cè)限。

2）方法的準(zhǔn)確度和精密度

取空白肉制品樣品以 0.5、10、100 μg/g Nisin 進(jìn)行添加， 取空白乳制品樣品以 1、30、300 μg/mL Nisin進(jìn)行添加，每種樣品、每個(gè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)或質(zhì)量濃度各取5個(gè)平行，分別用不同批次制備的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA試劑盒進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 Nisin多克隆抗體的制備

用Nisin直接免疫的兔子得到的抗血清效價(jià)比用Nisin-BSA偶聯(lián)物免疫的兔子的抗血清效價(jià)高，說(shuō)明Nisin具備免疫原性。 經(jīng)過(guò)8次免疫后，采血檢測(cè)抗血清的效價(jià)達(dá)到1∶10 000。純化后的抗體用紫外分光光度計(jì)測(cè)得蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為10.66 mg/mL。

2.2 包被抗原的選定結(jié)果

取Nisin-OVA偶聯(lián)物及Nisin分別包被后的檢測(cè)結(jié)果，見(jiàn)表1。

從表1可見(jiàn)，在相同條件下，Nisin-OVA偶聯(lián)抗原包被比用Nisin直接包被測(cè)得的OD值高，且?guī)? μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品的OD值在0標(biāo)準(zhǔn)品OD值的一半左右。因此用Nisin-OVA偶聯(lián)抗原作為包被原效果更好，這可能是因?yàn)镹isin是一種多肽，聚苯乙烯酶標(biāo)板對(duì)多肽的吸附性并不好，故需要將其與大分子蛋白進(jìn)行偶聯(lián)才能更好地吸附在酶標(biāo)板上。

表1 不同包被原的檢測(cè)結(jié)果Table 1 Different package of the original test results

2.3 抗原與抗體最佳稀釋倍數(shù)的確定

抗原和抗體按照不同的稀釋倍數(shù)稀釋后，采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法測(cè)得OD值，見(jiàn)表2。

表2 抗原抗體稀釋倍數(shù)的選定Table 2 Selected antigen-antibody dilution factor

由表2可以看出，當(dāng)抗原稀釋1 000倍、抗體稀釋10 000倍時(shí)，帶2.5 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品的抑制最好，綜合考慮成本以及誤差等因素，故選用抗原和抗體的最佳稀釋倍數(shù)均為10 000倍。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立結(jié)果

通 過(guò) 實(shí) 驗(yàn) 最 終 選 中 0、0.1、0.5、2.5、12.5、62.5 μg/mL這幾個(gè)質(zhì)量濃度作為曲線中標(biāo)準(zhǔn)品的最終質(zhì)量濃度。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)值（logC）為橫坐標(biāo)，以吸光度值的logit值為縱坐標(biāo)建立雙對(duì)數(shù)直線擬合曲線，數(shù)學(xué)模型為logit y=a+blogC。其中l(wèi)ogit y=ln（A/（A0-A）），A0為零標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值，A 為其他質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值。建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1，該曲線的IC50為1.1 μg/mL，曲線的相關(guān)系數(shù)為r=0.993 4。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.1 Standard curve

2.5 樣品前處理方法的選定

將含乳飲料用樣本稀釋液稀釋10倍，取50 mL用于分析。

將肉制品樣本剁碎成粉末狀，取1 g樣本至50 mL的離心管內(nèi)，加入5 mL的樣本稀釋液，充分震蕩混勻后靜置10 min，小心地提取上清液1 mL至2 mL的離心管中用于分析，注意不要吸到表層的油脂和底層的沉淀物。取50 μL用于分析。

經(jīng)驗(yàn)證，上述方法處理的樣本檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，且添加回收率正常。

2.6 方法的靈敏度

20次標(biāo)準(zhǔn)曲線的IC50測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

從表 3可知，IC50平均值為 1.16 μg/mL，浮動(dòng)范圍在1.0～1.4 μg/mL之間。經(jīng)計(jì)算IC50的平均值±3倍標(biāo)準(zhǔn)差的范圍為0.8～1.5 μg/mL；因此確定標(biāo)準(zhǔn)曲線 IC50應(yīng)在 0.8 μg/mL～1.5 μg/mL 的范圍之內(nèi)。

對(duì)空白含乳飲料和肉制品的最低檢測(cè)限的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表4和表5。

表3 IC50統(tǒng)計(jì)表Table 3 IC50tables μg/mL

表4 空白含乳飲料測(cè)定結(jié)果統(tǒng)計(jì)表Table 4 Blank milk drinks determination of the results of tables μg/mL

續(xù)表4

表5 空白肉制品測(cè)定結(jié)果統(tǒng)計(jì)表Table 5 Blank meat products determination of the results of tables μg/mL

續(xù)表5

從表4和表5可見(jiàn)，空白乳制品樣品的最低檢測(cè)限為0.85 μg/mL，空白肉制品樣品的最低檢測(cè)限為 0.45 μg/mL。

2.7 方法的準(zhǔn)確度和精密度

對(duì)樣本按不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行添加后，檢測(cè)得到的變異系數(shù)和添加回收率見(jiàn)表6和表7。

表6 含乳飲料樣品精密度及準(zhǔn)確度的試驗(yàn)Table 6 Milk beverage sample precision and accuracy test

表7 肉制品樣品精密度及準(zhǔn)確度的試驗(yàn)Table 7 Meat samples the precision and accuracy test

從表6和表7可以看出，對(duì)肉制品樣品以0.5、10、100 μg/g 3個(gè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的乳酸鏈球菌素進(jìn)行添加，測(cè)定變異系數(shù)和回收率，樣品的板內(nèi)變異系數(shù)為5.4%～8.9%之間，樣品的回收率在75.8%～112.4%之間；對(duì)乳制品樣品以 1、30、300 μg/mL 3 個(gè)質(zhì)量濃度的Nisin進(jìn)行添加，樣品板內(nèi)變異系數(shù)為5.4%～8.3%之間，樣品的回收率在78.6%～117.9%之間。

綜上所述，所測(cè)樣品的板內(nèi)變異系數(shù)在5.4%～8.9%之間，均小于20%，所測(cè)批內(nèi)、批間的變異系數(shù)小于20%。樣品的回收率均達(dá)75.8%～117.9%之間。

4 結(jié)語(yǔ)

建立了一種快速、簡(jiǎn)便的檢測(cè)Nisin的方法——間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附法。該方法利用預(yù)先包被在酶標(biāo)板孔上的抗原（Nisin-OVA偶聯(lián)物）和樣本中的Nisin和抗體（抗Nisin多克隆抗體）競(jìng)爭(zhēng)性的結(jié)合原理，用酶標(biāo)二抗（羊抗兔抗抗體）與已經(jīng)結(jié)合的抗原抗體結(jié)合物反應(yīng)，進(jìn)行Nisin的檢測(cè)分析。利用結(jié)合的酶標(biāo)記物使無(wú)色的底物產(chǎn)生顏色深淺，以進(jìn)行定性或定量檢測(cè)。該方法穩(wěn)定性、重復(fù)性好，其檢測(cè)低限為:牛奶、飲料、乳制品為1.0 mg/L（mg/kg）；肉制品為 0.5 mg/kg，檢測(cè)范圍 0.5～600 mg/kg（mg/L）之間。用該方法制備的試劑盒經(jīng)穩(wěn)定性試驗(yàn)驗(yàn)證，在4℃環(huán)境下可穩(wěn)定6個(gè)月以上，達(dá)到應(yīng)用要求。

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