趙雪淞， 梁 飛， 胡彥波， 夢 月， 周義發(fā)

（1.遼寧工程技術(shù)大學(xué) 礦業(yè)學(xué)院，遼寧 阜新 123000；2.東北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長春130024）

人參是百草之王，在我國已有2000多年的藥用歷史，具有多種藥理學(xué)活性，對神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)及免疫系統(tǒng)等均有作用。人參皂苷是人參的主要活性成分，從人參中分離出的人參皂苷有40余種[1]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，有些在人參中含量很低的稀有人參皂苷如Rg3、C-K、Rh2等具有優(yōu)異的抗腫瘤活性，可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和抗腫瘤誘導(dǎo)的血管新生等，有重要的藥用價值[2-5]。但是，稀有人參皂苷在人參中的含量太低，無法從人參中直接提取，而現(xiàn)有的化學(xué)合成技術(shù)還無法實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，因此，如何高效大量制備稀有人參皂苷成為科學(xué)研究的焦點。

稀有人參皂苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)與人參中某些含量高的人參皂苷（如Rb1）相比，只是缺少了一個或幾個糖基。理論上可以通過改變某些高含量人參皂苷的結(jié)構(gòu)來獲得稀有人參皂苷。結(jié)構(gòu)修飾的方法主要有化學(xué)轉(zhuǎn)化法和生物轉(zhuǎn)化法。生物轉(zhuǎn)化法具有反應(yīng)條件溫和、專一性強、得率高等優(yōu)點，是獲得稀有人參皂苷的有效途徑，而優(yōu)良菌種或菌株的篩選是生物轉(zhuǎn)化成敗的關(guān)鍵因素[6]。人參中含量最高的人參皂苷是Rb1，其糖基的連接鍵為β-葡萄糖苷鍵，微生物中β-葡萄糖苷酶酶活高的菌種主要是霉菌[7]，因此霉菌是篩選轉(zhuǎn)化菌株的良好來源。在作者所在研究團隊以前的研究中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些優(yōu)良的稀有人參皂苷轉(zhuǎn)化菌株及其轉(zhuǎn)化酶[8-10]。作者從10種霉菌中篩選出1種能轉(zhuǎn)化高含量的原人參二醇型皂苷為稀有人參皂苷C-K的菌株，并結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)進行了菌種鑒定，繼而研究了該菌的轉(zhuǎn)化特性。研究結(jié)果為稀有人參皂苷C-K的大量制備奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

10種霉菌，采自長春市郊茄科植物病原組織，PDA培養(yǎng)基4℃暗保存；人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品，購自成都曼斯特生物技術(shù)有限公司；人參皂苷混合物及人參皂苷單體，由作者所在實驗室制備，具體制備方法參見文獻 [11]；DNA marker，Invitrogen公司提供；凝膠回收試劑盒，QIAGEN公司提供；CTAB，Amresco公司提供；氯仿、甲醇等化學(xué)試劑，均為北京化工廠生產(chǎn)。

1.2 儀器與設(shè)備

BCN-1360B生物超凈工作臺，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司制造；YXQ-LS-30SII立式壓力蒸汽滅菌器，上海博訊實業(yè)公司制造；HZQ-C空氣浴振蕩器，哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠制造；Z36HK低溫高速離心機，德國Hermle制造；倒置熒光顯微鏡，日本Olympus制造；DYCP-31D水平電泳槽，北京市六一儀器廠制造；紫外/可見凝膠成像系統(tǒng)UVItec制造；PCR儀，ABI公司制造。

1.3 方法

1.3.1 分析方法 TLC分析采用G 60硅膠板，展開劑 CHCl3-MeOH-H2O（體積比 65∶35∶10，下層）。顯色劑為體積分?jǐn)?shù)5%硫酸乙醇，105℃加熱5 min。展開方式為上行展開。

1.3.2 人參皂苷轉(zhuǎn)化菌株的篩選 供試菌種置于V8汁液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，130 r/min，28℃，培養(yǎng) 8 d 后，紗布過濾，8 000 g、4 ℃、離心 20 min，棄去上清，得到孢子。將孢子懸浮在20 mmol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH 5.0）中，在 130 r/min、28 ℃條件下振蕩培養(yǎng)24 h，然后加入人參皂苷儲備液（人參皂苷樣品溶于pH 5.0 20 mmol/L的醋酸-醋酸鈉緩沖液中并通過0.2 μm的濾膜過濾除菌），使孢子的終濃度為5×106個/mL，底物的終質(zhì)量濃度為0.25 mg/mL，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)0～5 d。從加入人參皂苷的0時開始取樣，每隔24 h取樣一次，加入等體積的正丁醇萃取，上層正丁醇相減壓蒸干，重新溶于質(zhì)量分?jǐn)?shù)40%乙腈水溶液中，TLC檢測轉(zhuǎn)化結(jié)果。

1.3.3 菌種形態(tài)鑒定 PDA培養(yǎng)基接種3.26號霉菌，30℃恒溫培養(yǎng)，觀察菌落的形態(tài)、顏色；挑取菌絲，“Z”型接種，用滅菌的蓋玻片垂直“Z”線插入到培養(yǎng)基中培養(yǎng)，取蓋玻片顯微觀察。

1.3.4 菌種分子生物學(xué)鑒定 鑒定采用rDNA-ITS（18S rRNA基因-ITS）序列分析方法。具體方法為:V8汁液體培養(yǎng)基（1 L培養(yǎng)基含有200 mL V8汁和2 g CaCO3）30℃振蕩培養(yǎng)3.26號菌株5 d，取菌絲體預(yù)凍后加液氮研磨，CTAB法提取霉菌DNA，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%瓊脂糖凝膠電泳純化。ITS基因的擴增使用 真 菌 通 用 引 物 ， 正 向 引 物 （ITS1）:5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，19bp； 反 向 引 物（ITS4）:5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′，20 bp（http://www.biology.duke.edu/fungi/mycolab/primers.htm#Internal transcribed spacer （ITS） region primers）。ITS1和ITS4由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性4 min，94℃變性 45 s，48 ℃退火 5 s，72 ℃延伸 3 min，30個循環(huán)，72℃終延伸10 min，4℃保溫60 min。ITS擴增后的產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的瓊脂糖凝膠電泳后，回收條帶送至北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司測序。

1.3.5 人參皂苷水解酶制備 V8汁液體培養(yǎng)基，130 r/min、30℃恒溫振蕩培養(yǎng)5 d。發(fā)酵液經(jīng)6層紗布過濾、離心（4 ℃、1 200 r/min、20 min）后得到粗酶液。粗酶液中加入體積分?jǐn)?shù)5%的DEAE-纖維素4℃條件下振蕩吸附12 h，轉(zhuǎn)入層析柱（Φ3.2 cm×28 cm），粗酶液中未結(jié)合的成分在裝柱過程中流出，結(jié)合在DEAE-纖維素上的成分以含有 0、0.25、0.5、0.75、1 mol/L NaCl的緩沖液 A（25 mmol/L pH 5.0，NaAc-HAc）進行梯度洗脫，洗脫體積流量為3 mL/min，每個梯度洗脫2倍柱體積，洗脫液每50 mL收集一管。收集有酶活性的級分、透析（透析液為緩沖液A，4℃透析24 h）后得到部分純化的人參皂苷水解酶E-I。該酶的制備過程以A280nm處紫外光吸收值表征各級分的蛋白質(zhì)含量，以對硝基苯酚-β-D-葡萄糖苷（pNPG）法表征酶活性。

1.3.6 轉(zhuǎn)化途徑分析 4 mg/mL人參皂苷250 μL和2 250 μL酶液在40℃保溫，然后加入等體積的正丁醇終止反應(yīng)。正丁醇相進行TLC分析。

1.3.7 最適pH值和最適反應(yīng)溫度測定 酶的最適pH值測定選用pH 2.0～8.0的25 mmol/L Na2HPO4-檸檬酸緩沖液，1個pH值為一個梯度。測定方法為:取各pH值的Na2HPO4檸檬酸緩沖液450 μL（pH 分別為 2.5～8.0）， 加入純化后的 GE-I 20 μL，再加入pNPG 30 μL，37℃保溫1 h后，加入2.5 mL NaOH（0.25 mol/L）終止反應(yīng)，測定酶活力。最適合pH值下的酶活力記作100%，其他pH值下的酶活力為其相對百分比。酶的最適反應(yīng)溫度測定選用30～80℃，5℃為一個梯度。測定方法為取450 μL醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH 5.0），加 20 μL GE-I，30 μL pNPG（5 mg/mL），各自溫度下避光反應(yīng) 1 h，然后加入2.5 mL NaOH（0.25 mol/L）溶液終止反應(yīng)，測定酶活力。最適溫度下的酶活力記作100%，其他溫度下的酶活力為其相對百分比。

2 結(jié)果與討論

2.1 轉(zhuǎn)化菌株的篩選

因為分離純化得到人參皂苷單體的成本較高，此步試驗采用人參皂苷Rb1、Rb2、Rc和少量Rd的混合物為底物，從10種霉菌中篩選稀有人參皂苷C-K轉(zhuǎn)化菌株。圖1顯示了轉(zhuǎn)化5 d后的結(jié)果:3.23、3.24、3.25、3.26、3.27 和 3.28 號菌株能夠轉(zhuǎn)化底物，產(chǎn)生低極性的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，但是只有3.26號菌株能夠轉(zhuǎn)化底物為稀有人參皂苷C-K，其轉(zhuǎn)化途徑可能是:原人參二醇型皂苷→Rd→F2→C-K。因此，選擇3.26號菌株作進一步研究。

圖 1 TLC分析10種霉菌生物轉(zhuǎn)化人參皂苷 Rb1、Rb2、Rc和Rd的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物（S代表標(biāo)樣）Fig.1 TLC Analysis of the products of biotransformation of ginsensodies Rb1、Rb2、Rc and Rd by 10 fungi（S represents standard ginsenosides）

2.2 菌種鑒定

2.2.1 形態(tài)鑒定 3.26號菌株的菌落初呈白色、絨毛狀，培養(yǎng) 7 d后，菌落顏色略顯紅色（圖 2（a））。 顯微觀察菌絲的形態(tài)，有不規(guī)則的磚壁狀橫隔，分生孢子散落，顏色較深（圖 2（b）（c））。經(jīng)查找真菌鑒定手冊[12]，該菌的形態(tài)特征與半知菌類叢梗孢目瘤座孢科附球霉屬（Epicoccum）真菌相近。

2.2.2 分子生物學(xué)鑒定 ITS（Internal Transcribed Spacer，內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)）序列分析是當(dāng)前真菌鑒定的重要手段。由于真菌核糖體DNA ITS區(qū)序列在生物進化過程中高度保守，因此，即使是親緣關(guān)系非常接近的2個種都能在ITS序列上表現(xiàn)出差異，顯示最近的進化特征。作者用CTAB法提取3.26號菌株的基因組DNA，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%瓊脂糖凝膠電泳，發(fā)現(xiàn)該菌的基因組 DNA 大約 14 000 bp（圖 3（a）），將其作為PCR模板擴增ITS基因，PCR產(chǎn)物與DNA marker比較， 大小在 500～650 bp 之間 （圖 3（b））。PCR產(chǎn)物回收后測序，然后登錄GenBank數(shù)據(jù)庫，將測序結(jié)果用Blast進行同源性分析，發(fā)現(xiàn)與附球霉屬菌株Epicoccum sp.SP3 18S rRNA基因的相似度為99%（圖4）。上述結(jié)果說明，3.26號菌株為半知菌類叢梗孢目瘤座孢科附球霉屬（Epicoccum）真菌。

圖2 3.26號菌株的菌落和菌絲B和C（10×40倍）形態(tài)Fig.2 Shapes of colony and hyphae of strain sp.3.26

圖3 3.26號菌株基因組DNA電泳圖譜和ITS基因PCR產(chǎn)物電泳圖譜Fig.3 AgarosegelelectrophoresisofgenomeDNA extracted from strain sp. 3.26 and PCR production of ITS gene

圖4 3.26號菌株ITS序列與Epicoccum sp.SP3比對結(jié)果Fig.4 Sequence alignment of ITS sequences obtained from strain sp.3.26.The ITS sequences of strain sp.3.26 are aligned with those of Epicoccum sp.SP3

2.3 人參皂苷水解酶的制備

因為酶轉(zhuǎn)化法有流程短、產(chǎn)率高、產(chǎn)物易分離純化、不需要無菌操作等優(yōu)點[13]，同時為了進一步驗證3.26號菌株的轉(zhuǎn)化能力和轉(zhuǎn)化途徑，從3.26號菌株的培養(yǎng)液中分離制備了人參皂苷水解酶粗酶E-I。從圖5可以看出，經(jīng)DEAE-纖維素柱層析后，在氯化鈉溶液濃度為0.25 mol/L時有酶活峰出現(xiàn)，收集酶活峰，記為E-I。

圖5 DEAE-纖維素離子交換層析制備人參皂苷水解酶E-IFig.5 Preparation of ginsenoside-hydrolyzing enzyme EI by Ion-exchange chromatography on DEAE-cellulose

2.4 人參皂苷水解酶E-I的最適pH值和最適溫度

從圖6可以看出，E-I的最適pH值為5.0，最適溫度為40℃。已有研究表明，大部分β-葡萄糖苷酶均為酸性蛋白質(zhì)，最適pH值大都在酸性范圍內(nèi)，最適溫度分布在30～110℃[14]。本研究結(jié)果符合這一規(guī)律。

2.5 轉(zhuǎn)化途徑分析

用人參皂苷水解酶E-I在上述最適pH值和溫度條件下分別轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb1和Rb2、Rc混合物，TLC檢測結(jié)果。如圖7所示，人參皂苷Rb1的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物有3種:Rd、F2和C-K，轉(zhuǎn)化6 h后，產(chǎn)生Rd和F2，轉(zhuǎn)化12 h后，出現(xiàn)第3種產(chǎn)物C-K，轉(zhuǎn)化48 h后，底物人參皂苷Rb1和產(chǎn)物Rd完全消失，剩下產(chǎn)物 F2和 C-K（圖 7（a））；人參皂苷 Rb2和 Rc 的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物與人參皂苷Rb1的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物相同。不同的是，人參皂苷Rb2和Rc的轉(zhuǎn)化效率明顯低于Rb1，Rb2和Rc轉(zhuǎn)化24 h后才有少量C-K出現(xiàn)，轉(zhuǎn)化48 h后，仍然存在很多Rd（圖7（b））。上述結(jié)果說明:3.26號菌株能夠轉(zhuǎn)化高含量的原人參二醇型皂苷為稀有人參皂苷C-K，轉(zhuǎn)化途徑為:原人參二醇型皂苷→Rd→F2→CK；3.26號菌株分泌的糖苷酶具有廣泛的底物專一性，但是對葡萄糖苷鍵的專一性更高。因為，原人參二醇型皂苷Rb1、Rb2和Rc具有共同的苷元（原人參二醇）和 C-3 位的糖鏈（Glc β-（1，2）-Glc），不同之處在于C-20位的糖鏈:Rb1的C-20位是2個葡萄糖以β（1→6）糖苷鍵相連接，Rb2的C-20位是一個吡喃型阿拉伯糖和一個葡萄糖以α（1→6）糖苷鍵相連接，Rc的C-20位是一個呋喃型阿拉伯糖和一個葡萄糖以α-（1→6）糖苷鍵相連接（圖8），而該菌分泌的糖苷酶既能水解人參皂苷Rb1 C-20位的糖鏈，也能水解Rb2和Rc C-20位的糖鏈，說明其具有廣泛的底物專一性。

圖6 E-I的最適pH值和最適溫度Fig.6 Optimal pH and temperature of E-I

圖7 TLC分析E-I對人參皂苷Rb1和Rb2、Rc的轉(zhuǎn)化Fig.7 TLC Analysisofthe biotransformation of ginsensodies Rb1and Rb2、Rc by E-I

圖8 3.26號菌株轉(zhuǎn)化原人參二醇型皂苷的轉(zhuǎn)化途徑Fig.8 Biotransformation pathways of protopanaxadiol-type saponins by strain sp.3.26

3 結(jié)語

從10種霉菌中篩選出1種能夠生物轉(zhuǎn)化主要的人參皂苷Rb1、Rb2和Rc為稀有人參皂苷C-K的3.26號菌株。經(jīng)形態(tài)學(xué)和ITS基因序列分析，確定3.26號菌株屬于附球霉屬（Epicoccum）真菌。采用DEAE-纖維素離子交換層析，從3.26號菌株的培養(yǎng)液中分離出人參皂苷水解酶粗酶E-I，確定E-I的最適pH值和最適溫度分別為pH 5.0和40℃。在上述最適條件下，用E-I對該菌轉(zhuǎn)化人參皂苷的具體途徑進行研究，發(fā)現(xiàn)該菌產(chǎn)生的糖苷酶具有廣泛的底物專一性，它既能水解人參皂苷Rb1，也能水解Rb2和Rc。3.26號菌株對人參皂苷的生物轉(zhuǎn)化途徑為:人參皂苷 Rb1、Rb2、Rc→Rd→F2→C-K。 該菌能將主要的原人參二醇型皂苷都轉(zhuǎn)化為C-K，使得可以采用原人參二醇型皂苷混合物為底物進行生物轉(zhuǎn)化，大大降低了人參皂苷分離純化的成本，而采用粗酶進行轉(zhuǎn)化，明顯提高了C-K產(chǎn)率，同時節(jié)省了分離純酶的成本。3.26號菌株的轉(zhuǎn)化特性非常有利于稀有人參皂苷C-K的工業(yè)制備。

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