■李 茜 王樹啟 游翠紅 李遠友

（汕頭大學海洋生物研究所，廣東省海洋生物技術重點實驗室，廣東汕頭515063）

隨著飼料工業(yè)的發(fā)展，常規(guī)飼料原料受制于產(chǎn)量和供求關系，價格不斷上漲，因此，飼料行業(yè)將越來越重視非常規(guī)飼料的開發(fā)，尤其是不能被人類直接利用的植物原料，如棉粕、菜籽粕、葵花籽粕以及海藻等。海藻在海洋中分布廣泛，營養(yǎng)價值高，富含海藻多糖、礦物質(zhì)、維生素、游離氨基酸、脂肪酸、天然色素及未知生長因子(UGF)等營養(yǎng)成分。自古以來，我國沿海居民就有栽培、食用大型海藻的傳統(tǒng)。同樣，作為潛在的非常規(guī)飼料原料的開發(fā)，大型海藻日益引起人們的重視，尤其是在水產(chǎn)動物飼料領域有巨大的應用潛力。

目前，大部分潛在的可用于飼料生產(chǎn)的海藻都具有蛋白、脂肪含量較低，碳水化合物含量較高的特點，某些海藻的碳水化合物含量可達40%以上。但大部分水產(chǎn)動物，特別是魚類，對碳水化合物的利用效率較低，而且海藻中的碳水化合物又多以纖維素、昆布多糖、瓊膠等非淀粉多糖（NSP）的形式存在，不僅本身不易消化，還影響動物對其他營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。一些研究表明，在水產(chǎn)動物飼料中添加過量的海藻的確會影響其正常生長。例如，在尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)飼料中添加一定量（30%）的石莼(Ulva rigida)后，羅非魚的生長性能顯著下降。相似的結果也見于紅羅非魚(Oreochromis sp.)、虹鱒和黃斑藍子魚的養(yǎng)殖實驗，飼料中添加一定量的海藻導致魚體生長性能下降的具體原因目前尚不清楚，一方面可能與魚類對海藻中碳水化合物利用效率低下有關，另一方面可能是海藻中NSP的抗營養(yǎng)作用。NSP是植物蛋白源中最主要的抗營養(yǎng)因子，是限制魚類利用植物蛋白源的制約因素之一。目前，解決這一問題的有效方法就是飼料加工過程中加入非淀粉多糖酶來降解其中的非淀粉多糖。NSP不能被動物的內(nèi)源消化酶消化（少數(shù)反芻動物除外），但可被相應的NSP酶降解成寡糖或者單糖。非淀粉多糖包括纖維素、半纖維素、果膠類物質(zhì)和抗性淀粉等，而非淀粉多糖酶也相應地包括木聚糖酶、纖維素酶、β-葡聚糖酶、果膠酶等。但是目前關于非淀粉多糖酶對海藻這一非常規(guī)飼料原料酶解效果的研究并不多。石莼、滸苔在我國沿海地區(qū)資源量較多，但目前尚未找到有效的利用途徑；龍須菜目前主要用于提煉瓊膠，但仍有大量殘次的龍須菜沒有被利用。這些低值、殘次海藻殘留近海不僅是資源的巨大浪費，其腐爛物還會帶來嚴重的環(huán)境污染。為此，本研究擬以上述幾種在水產(chǎn)飼料中具有應用潛力的海藻為對象，比較纖維素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶等非淀粉多糖酶在單獨或混合情況下對3種海藻的體外酶解效果，以獲得這些酶的適宜添加量，為開發(fā)基于海藻原料的高效低成本的魚類配合飼料提供基礎資料和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗海藻

大型海藻石莼、龍須菜和滸苔采自于廣東省海洋生物技術重點實驗室南澳臨海實驗站附近海域，在60℃烘干后粉碎過80目篩得海藻粉。

1.2 主要試劑與溶劑

纖維素酶(20 000 U/g)、木聚糖酶(50 000 U/g)、β-葡聚糖酶（20 000 U/g）購于寧夏和氏璧生物技術有限公司，其他藥品和試劑均使用國產(chǎn)AR級試劑。

磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液：由0.2 mol/l磷酸氫二鈉與0.1 mol/l檸檬酸溶液按照29∶21混合得到，pH值為5.6。

DNS試劑：稱取3，5-二硝基水楊酸3.15 g，加入500 ml水攪拌，水浴至45℃，然后加入20 g氫氧化鈉，攪拌直至溶液澄清透明，再加入四水酒石酸鉀鈉91 g、苯酚2.5 g和無水亞硫酸鈉2.5 g，繼續(xù)45℃水浴，直到所有物質(zhì)完全溶解，冷卻至室溫，定容至1 000 ml，過濾，取濾液保存在棕色瓶中，室溫下存放7 d后可以使用，有效期為6個月。

葡萄糖標準液：稱取1 g無水葡萄糖，溶解于磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液中，定容至100 ml。分別吸取葡萄糖溶液1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00 ml，用磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液定容至100 ml，配置成濃度為0.10～0.60 mg/ml的標準液。

不同濃度酶溶液：分別將纖維素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶在pH值為5.6的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液中均配置成40、80、120、160、200 U/ml。

1.3 實驗方法

單酶解實驗：各取1 g藻粉懸濁于19 ml pH值為5.6的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液中，攪拌均勻后分別加入不同濃度的纖維素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶酶液各1 ml，反應體積均為20 ml，對照組不加酶，每個處理三個平行?？紤]到魚體的適宜生長溫度為25℃左右，飼料在魚體的消化時間約為6 h的情況，酶解條件設為25℃、6 h。即在25℃的搖床上100 r/min反應6 h后，取反應液在4 000 r/min離心10 min，取上清液采用DNS法測定溶液中還原糖含量。

混合酶解實驗：確定了單酶的適宜添加量后，分別按每種藻粉3種單酶適宜添加量的25%、50%、75%、100%將3種單酶進行混合，開展酶解實驗，反應體系和測定方法同上。

DNS法測定還原糖含量：二硝基水楊酸（DNS）與還原糖發(fā)生氧化還原反應，生成3-氨基-5-硝基水楊酸，該產(chǎn)物在煮沸條件下顯棕紅色，且在一定濃度范圍內(nèi)顏色深淺與還原糖含量成正比例關系，因此可以用比色法測定還原糖含量。根據(jù)師昆景的方法先用標準葡萄糖液建立標準曲線，再測出待測溶液的OD值，對照標準曲線算出測定溶液中的還原糖含量。具體方法如下：吸取2 ml磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，加2 ml DNS試劑，沸水浴5 min后冷卻至室溫作為標準空白樣，吸取標準葡萄糖溶液各1 ml，加入1 ml緩沖液和2 ml DNS試劑，沸水浴5 min，冷卻至室溫，以標準空白樣調(diào)零，在540 nm處測定吸光度OD值，以葡萄糖濃度為Y軸，OD值為X軸做標準曲線。吸取待測上清液1 ml，加入1 ml緩沖液和2 ml DNS試劑，沸水浴5 min冷卻至室溫測定540 nm處OD值，參照標準曲線求出還原糖含量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

結果以每個處理3個平行的“平均值±標準誤（Mean±SE）”表示。

2 結果與分析

2.1 石莼酶解效果（見圖1、圖2）

圖1 纖維素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶對石莼的單酶解效果

圖2 纖維素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶對石莼的混合酶解效果

單酶解實驗結果顯示，纖維素酶、木聚糖酶以及β-葡聚糖酶對石莼藻粉都具有一定的酶解效果，溶液中還原糖含量都比對照組增加一倍以上（圖1）。其中，纖維素酶和木聚糖酶在120 U/g以上時溶液中還原糖含量達到1.0～1.05 mg/ml，并趨于穩(wěn)定，而β-葡聚糖酶在160 U/g以上時趨于平穩(wěn)，還原糖含量在1.4 mg/ml左右。因此，3種酶單獨使用時的適宜添加量分別為120、80、160 U/g，且在同一濃度下，β-葡聚糖酶的酶解效果最好。混合酶解結果顯示，混合添加量為單酶適宜添加量的75%時還原糖含量不再增加且比單酶酶解效果都好（圖2），因此，3種酶適宜混合添加量為：纖維素酶90 U/g、木聚糖酶60 U/g、β-葡聚糖酶120 U/g。

2.2 龍須菜酶解效果（見圖3、圖4）

圖3 纖維素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶對龍須菜的單酶解效果

圖4 纖維素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶對龍須菜的混合酶解效果

3種酶對龍須菜的單酶解效果見圖3，纖維素酶和木聚糖酶在160 U/g以上時溶液中還原糖含量分別穩(wěn)定在1.05 mg/ml和1.25 mg/ml，而β-葡聚糖酶在240 U/g以上時還原糖含量才趨于平穩(wěn)，并且含量為1.35 mg/ml，因此，3種酶單獨使用時的適宜添加量分別為160、160、240 U/g。在添加量為200 U/g以內(nèi)時，木聚糖的酶解效果一直處于最高，雖然β-葡聚糖酶的酶解效果最終最高，但是添加量也較高。從圖4可以看出，混合酶解時，也是在75%混合量效果最好，因此，3種酶適宜混合添加量為：纖維素酶120 U/g、木聚糖酶120 U/g、β-葡聚糖酶180 U/g。

2.3 滸苔酶解效果（見圖5、圖6）

圖5 纖維素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶對滸苔的單酶解效果

纖維素酶、木聚糖酶以及β-葡聚糖酶對滸苔的酶解效果相對于石莼和龍須菜較差，經(jīng)過酶解以后，纖維素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶分別在160、120和160 U/g達到適宜添加量，還原糖含量都在0.85 mg/ml左右，雖然纖維素酶的酶解效果最好，但3種酶的酶解效率差不多。混合酶解時，75%的混合比例已達到最好效果，因此，3種酶適宜混合添加量為纖維素酶120 U/g、木聚糖酶90 U/g、β-葡聚糖酶120 U/g。

圖6 纖維素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶對滸苔的混合酶解效果

3 討論

降解海藻多糖的酶可分為兩大類：第一種是能降解特有的海藻多糖降解酶類（如褐藻膠酶、褐藻糖膠酶、瓊膠酶、卡拉膠酶等）；另一類是能降解非特有海藻多糖的降解酶類（如葡聚糖酶、纖維素酶、甘露糖酶、果膠酶等），海藻多糖降解酶主要來源于海洋動物和海洋微生物。由于特有的海藻多糖酶生產(chǎn)成本較高，主要應用在食品和醫(yī)藥等方面，目前還沒有被作為飼料添加劑使用，因此，應用較多的是常規(guī)的非淀粉多糖酶，如纖維素酶、葡聚糖酶、木聚糖酶以及甘露聚糖酶等。

目前采用體外消化法評價非淀粉多糖酶效果主要集中在常規(guī)飼料原料，比如早秈稻谷及其糙米、小麥、豆粕、棉籽粕以及菜籽粕等，并且不同的酶制劑對不同飼料原料的酶解效果有很大差異性。本研究以幾種在水產(chǎn)飼料中有應用潛力的海藻為研究對象，探討了常用的非淀粉多糖酶對其的酶解效果。從海藻對酶的敏感程度來看，石莼和龍須菜對β-葡聚糖酶較為敏感，酶解后還原糖含量達到了1.35～1.40 mg/ml，而纖維素酶的酶解效果較差，還原糖含量均只有1.1 mg/ml左右。在滸苔中結果正好相反，β-葡聚糖酶的酶解效果較差，纖維素酶酶解效果最好，但是3種酶對滸苔的酶解效果都差不多，還原糖含量在0.85～0.9 mg/ml。從酶制劑對不同海藻的酶解效果來看，纖維素酶和木聚糖酶對龍須菜的酶解效果最好，還原糖含量分別達到了1.05 mg/ml和1.25 mg/ml左右，而對滸苔的酶解效果最差。β-葡聚糖酶對石莼的酶解效果最好，還原糖含量達到了1.40 mg/ml左右，對滸苔的酶解效果最差。綜上所述，纖維素酶、木聚糖酶以及β-葡聚糖酶對龍須菜和石莼都有較好的酶解效果，對滸苔的酶解效果則較差，這可能與海藻細胞內(nèi)糖類的組成和含量有關。龍須菜屬于紅藻，主要含有瓊膠和卡拉膠，富含α-1,3糖苷鍵和β-1,4糖苷鍵，而石莼和滸苔屬于綠藻，主要含有木聚糖和葡聚糖，富含α-1,6和β-1,4糖苷鍵。龍須菜和石莼可能含有較多的β-1,4糖苷鍵，因此，β-葡聚糖酶對這兩種海藻有較好的酶解效果，而滸苔雖然和石莼一樣屬于綠藻，但其酶解效果并沒有石莼好，并且3種酶對其酶解效果都不理想，這一點有待更深入的研究。

混合酶解時，應該考慮3種酶之間的比例以及總添加量，由于是按單酶的適宜添加量進行混合，而3種單酶適宜添加量之間已經(jīng)存在了一定比例，因此只考慮總添加量，并設置了4個梯度，從混合酶解效果來看，混合量在單酶適宜添加量的75%時已經(jīng)達到最好效果，石莼和龍須菜酶解液中的還原糖含量達到了1.6 mg/ml，滸苔中還原糖含量也達到了1.2 mg/ml。混合酶解效果比單酶解的效果都好，這可能是因為混合酶水解的糖苷鍵更加豐富，所以產(chǎn)生的還原糖量也更多。

海藻中糖類含量達到了40%以上，按照本實驗方法，如果完全分解成還原糖，溶液中還原糖含量應該至少達到20 mg/ml。但實驗結果顯示，最高的也只有1.6 mg/ml，這可能與選用的都是非特異性的海藻多糖降解酶有關。王昌義等考察了纖維素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶對鼠尾藻粉中非淀粉多糖的體外酶解效果，發(fā)現(xiàn)單酶解后還原糖含量均增加10%以上，混合酶解后還原糖含量增加50%以上。在本研究中，還原糖含量分別增加了100%(單酶解)和200%(混合酶解)以上。若要最大限度地降解海藻多糖，在以后的研究中可以進一步的選擇特異性的海藻多糖降解酶進行研究。

總之，本研究以酶制劑添加到飼料中為出發(fā)點，參考魚體的適宜生長溫度和食物在魚體的消化時間，得出每克藻粉中纖維素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶的單獨適宜添加量，在石莼中分別為120、80、160 U/g；龍須菜分別為160、160、240 U/g；滸苔分別為160、120、160 U/g。混合添加時在石莼中為90 U/g+60 U/g+120 U/g；龍須菜中為120 U/g+120 U/g+180 U/g；滸苔中為120 U/g+90 U/g+120 U/g。若以預處理飼料原料為出發(fā)點，則應該探索最佳的酶解條件，比如溫度、時間和pH值等，這有待更深入的研究。