李鷥鷥，汪秋寬，何云海，任丹丹，張澤宇

(大連海洋大學(xué) 遼寧水產(chǎn)品加工及綜合利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家海藻加工技術(shù)研發(fā)分中心，遼寧大連116023)

海帶在中國栽培歷史悠久，栽培區(qū)域廣，產(chǎn)量大，但海帶的精深加工產(chǎn)品少，對其中生物活性成分的開發(fā)應(yīng)用還遠(yuǎn)不夠，這主要受海帶種類限制以及加工技術(shù)及綜合利用水平低等因素影響。

多肋藻Costaria costata 隸屬于海帶目Laminaria-les 海帶科Laminariaceae 多肋藻屬Costaria，在中國無自然分布，在亞洲主要分布于日本及朝鮮半島海域，是營養(yǎng)價值較高的一年生大型褐藻［1］。近年來，對多肋藻的研究逐漸增多，主要是因其含有豐富的生物活性物質(zhì)巖藻聚糖硫酸酯。本研究中，作者以大連沿海栽培的多肋藻為原料，對多肋藻中活性成分巖藻聚糖硫酸酯的提取及其血脂調(diào)節(jié)作用進(jìn)行了研究，旨在為培育栽培新品種，綜合利用褐藻優(yōu)勢品種提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

多肋藻為大連沿海栽培的品種。

試驗(yàn)動物SPF 小鼠雌、雄各半，體質(zhì)量為(20 ±2)g，購自大連醫(yī)科大學(xué)遼寧省SPF 動物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

主要試劑:纖維素酶、果膠酶購于上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司，木瓜蛋白酶購于北京化學(xué)試劑公司;乙醇體積分?jǐn)?shù)為95%，其他試劑均為分析純;總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL - C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所;非諾貝特膠囊為法國利博福尼制藥公司產(chǎn)品，其化學(xué)名為2 -［4 -(4 -氯苯甲?；?苯氧基］-2 -甲基-丙酸甲基乙酯。

主要儀器與設(shè)備:FW100 高速萬能粉碎機(jī)、LD5 -2A 離心機(jī)、HH-4 數(shù)顯恒溫水浴鍋。

1.2 方法

1.2.1 基本成分的測定方法 用常壓干燥法、馬福爐灼燒法、凱氏定氮法和索氏抽提法分別測定水分、灰分、蛋白質(zhì)和脂肪含量［2］，用過碘酸氧化法測定甘露醇含量［3］，用酶重量法測定總膳食纖維含量［4］，用SC/T 3010 -2001 中的方法測定碘含量［5］。

1.2.2 巖藻聚糖硫酸酯提取工藝的優(yōu)化 采用復(fù)合酶解法［6］提取巖藻聚糖硫酸酯粗品，采用苯酚-硫酸法測定總糖含量［7］，采用鹽酸水解- 硫酸鋇重量法測定硫酸根含量［8］，采用次甲基藍(lán)分光光度法測定巖藻聚糖硫酸酯含量［9］。

巖藻聚糖硫酸酯、總糖、硫酸根含量(%)=各項(xiàng)在粗品中的含量(%)× 粗品的提取率(%)。

1.2.3 粗提物的血脂調(diào)節(jié)作用分析

1)飼料制作。高脂飼料配方為豬油10%、膽固醇2%、膽鹽0.5%、基礎(chǔ)料87.5%。制作時，將基礎(chǔ)料(正常飼料)粉碎與膽固醇、膽鹽逐步混勻后，注入飼料加工機(jī)中邊攪拌邊加水，緩慢倒入融化狀態(tài)的豬油，待混合攪拌均勻后擠壓成型，用烘箱烘干，常溫下保存。

2)動物分組及試驗(yàn)。將SPF 小鼠暫養(yǎng)3 d 后，隨機(jī)分為8 組:正常對照組、高脂模型對照組、陽性對照組和巖藻聚糖硫酸酯組(F1 ～F5 組)，每組10 只小鼠。除正常對照組飼喂基礎(chǔ)飼料外，其他試驗(yàn)組均飼喂高脂飼料;飼養(yǎng)方式為自由取水取食。

每天投喂飼料之前對各試驗(yàn)組小鼠灌胃1次，灌胃體積均為2 mL;正常對照組及高脂模型對照組灌胃蒸餾水;陽性對照組灌胃非諾貝特，劑量為每天40 mg/kg;F1 ～F5 組灌胃不同劑量的巖藻聚糖硫酸酯粗提物，劑量分別為每天100、300、500、700、900 mg/kg。

3)試驗(yàn)指標(biāo)的測定。小鼠連續(xù)給食并灌胃14 d 時，從眼框采血，然后斷頸處死。血液在無菌試管中保存，對血清中TC、TG、HDL -C、LDL -C的含量進(jìn)行測定，測定方法參照南京建成生物工程有限公司試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0 進(jìn)行單因素方差分析，用t 檢驗(yàn)法進(jìn)行組間多重比較，以P＜0.05表示有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 基本成分

經(jīng)測定，多肋藻中各項(xiàng)基本成分的含量分別為水分10.55%、灰分15.40%、蛋白質(zhì)11.13%、脂肪2.00%、總膳食纖維48.05%、碘0.10%、甘露醇11.30%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)。將多肋藻基本成分的含量轉(zhuǎn)化為純干基含量，并與中國科學(xué)院衛(wèi)生研究所頒布的干海帶［10］基本成分的含量轉(zhuǎn)化為干基含量值對比發(fā)現(xiàn)，多肋藻干基中蛋白質(zhì)、灰分、脂肪的含量分別為12.44%、17.22%和2.24%，較普通干海帶干基中蛋白質(zhì)、灰分、脂肪含量分別高出9.4%、14.79%和0.11%。

2.2 正交試驗(yàn)

采用復(fù)合酶法(纖維素酶、果膠酶、蛋白酶質(zhì)量比為3∶ 1∶ 1，三者的酶活力分別為18.70、22.97、15.90 U/mg)提取巖藻聚糖硫酸酯。選取加酶量、溫度、pH 值和時間4 個因素，以巖藻聚糖硫酸酯、總糖和總硫酸根含量為試驗(yàn)指標(biāo)，設(shè)計4 因素3 水平的正交試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計方案及試驗(yàn)結(jié)果見表1、表2。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Tab.1 The factors and levels of the orthogonal experiment

對正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行極差分析(表2)，結(jié)果表明:以巖藻聚糖硫酸酯含量為試驗(yàn)指標(biāo)的因素影響程度依次為C ＞B ＞D ＞A，最佳提取方案為A3B3C3D1，最佳試驗(yàn)組合為A3B3C2D1;以總糖含量為試驗(yàn)指標(biāo)的因素影響程度依次為C ＞D ＞B ＞A，最佳提取方案為A3B3C2D1，最佳試驗(yàn)組合為A3B3C2D1;以總硫酸根含量為試驗(yàn)指標(biāo)的因素影響程度依次為C ＞A ＞D ＞B，最佳提取方案為A3B2C2D3，最佳試驗(yàn)組合為A3B3C2D1。

由于3 個試驗(yàn)指標(biāo)的最佳試驗(yàn)組合均為A3B3C2D1，且在此組合條件下，巖藻聚糖硫酸酯、硫酸根與總糖含量均明顯高于其他試驗(yàn)組，因此，本研究中確定最佳提取工藝組合為A3B3C2D1，即酶加量為0.10%，溫度為50 ℃，pH 為5.5，酶解時間為30 min。

對確定的最佳提取工藝進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，以確保工藝的可靠性和正確性，將酶加量為0.10%，溫度為50 ℃，pH 為5.5，酶解時間為30 min 的提取方法重復(fù)進(jìn)行5次試驗(yàn)，并測定提取物中巖藻聚糖硫酸酯、總糖和總硫酸根含量。結(jié)果表明，最佳提取條件下巖藻聚糖硫酸酯含量為1.859% ±0.092%，總糖含量為1.416% ±0.064%，總硫酸根含量為0.972% ±0.057%，試驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性較好，表明此提取方案的穩(wěn)定性程度較高，與何云海等［11］報道的用戊聚糖復(fù)合酶酶解提取其他種類海帶巖藻聚糖硫酸酯含量為1.845%的結(jié)果相近。

表2 復(fù)合酶酶解多肋藻的正交試驗(yàn)設(shè)計及試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 The design and the results of orthogonal test in the sea weed Costaria costata hydrolysates made by a mixture of enzymes

2.3 巖藻聚糖硫酸酯對小鼠血脂的調(diào)節(jié)作用

從表3可見:高脂模型組中小鼠血清中的TC、TG、LDL-C 含量均顯著性高于正常對照組(P＜0.05)，說明通過試驗(yàn)期間高脂飼料的喂養(yǎng)，成功建立了小鼠高血脂模型［10］;陽性對照組和各巖藻聚糖硫酸酯組小鼠血清中的TC 含量均顯著性低于高脂模型組(P＜0.05)，且當(dāng)巖藻聚糖硫酸酯劑量為100 ～900 mg/(kg·d)時，隨著灌胃劑量的增加小鼠血清中TC 含量降低，當(dāng)巖藻聚糖硫酸酯劑量為900 mg/(kg·d)時，TC 含量低于陽性對照組水平，更接近于正常對照組;當(dāng)巖藻聚糖硫酸酯劑量為500 ～900 mg/(kg·d)時，小鼠血清中的TG含量均顯著性低于高脂模型組(P＜0.05)，但無明顯濃度趨勢，當(dāng)巖藻聚糖硫酸酯劑量為700 mg/(kg·d)時，TG 含量低于陽性對照組水平;當(dāng)巖藻聚糖硫酸酯劑量為500 ～900 mg/(kg·d)時，小鼠血清中的LDL-C 含量均顯著性低于高脂模型組(P＜0.05)，接近正常水平，但無明顯濃度趨勢;HDL-C 含量在陽性對照組中呈最高水平，但巖藻聚糖硫酸酯劑量組與正常對照組均無顯著性差異(P ＞0.05)。

3 討論

巖藻聚糖硫酸酯的主要成份為α-L-巖藻糖-4-硫酸酯［12］，存在于海藻細(xì)胞的細(xì)胞壁基質(zhì)中，具有抗氧化［13-15］、抗腫瘤［16］、抗動脈粥樣化［17］、抗衰老［18］、保護(hù)肝臟［19］等活性作用。添加的纖維素酶主要用于分解細(xì)胞壁。多肋藻中富含果膠質(zhì)、蛋白質(zhì)，在浸提過程中會增加浸提液的黏稠度［20］，使巖藻聚糖硫酸酯不易溶出。本研究中優(yōu)化了多肋藻巖藻聚糖硫酸酯的提取工藝，得到最佳提取方案為酶加量0.10%、酶解溫度50 ℃、酶解pH 5.5、酶解時間30 min，在此條件下提取產(chǎn)物中巖藻聚糖硫酸酯含量為1.859% ± 0.092%，總糖含量為1.416% ± 0.064%，總硫酸根含量為0.972% ±0.057%。

表3 多肋藻巖藻聚糖硫酸酯對小鼠血脂的影響(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n=10)Tab.3 The effect of fucoidan from the sea weed Costaria costata on the mice blood－lipid(mean±S.D.，n=10)

高血脂是不良飲食導(dǎo)致的常見病癥，總膽固醇是血脂的直觀體現(xiàn)，甘油三酯是致動脈粥樣化的一項(xiàng)重要的臨床指標(biāo)，低密度脂蛋白起到運(yùn)輸體內(nèi)膽固醇的作用，而高密度脂蛋白在血脂過高時，可作為逆向轉(zhuǎn)運(yùn)膽固醇的載體，加快血液中膽固醇的分解［21］。歸納降血脂藥物的作用方式一般有3種［22-24］:第一種是活性物質(zhì)促進(jìn)高密度脂蛋白的合成;第二是膽固醇在腸道中被分解為膽汁酸，活性物質(zhì)與膽汁酸作用，加快膽固醇的分解、轉(zhuǎn)化，使其不被人體吸收;第三種是活性物質(zhì)直接包裹住腸道中的脂質(zhì)，減少腸道對脂類的吸收，使得血脂中的膽固醇受到控制。本試驗(yàn)結(jié)果表明，巖藻聚糖硫酸酯能顯著抑制小鼠高脂攝食過程中血清總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白的升高，高密度脂蛋白含量較正常對照組有所增高，但作用不顯著，因此，推測巖藻聚糖硫酸酯降血脂的作用方式可能為后兩種，其作用機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

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