陳彥伶，牟群，潘連德，劉譯濃，王愛卿，鄭佳瑞，邱進(jìn)

(1.上海海洋大學(xué) 省部共建水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海201306;2.四川省農(nóng)科院水產(chǎn)研究所，四川宜賓644000)

中華鱉Trionyx sinensis 集約化養(yǎng)殖的疾病診斷及其控制效果，已成為決定其經(jīng)濟(jì)效益的重要問題。中華鱉“白底板”病和具有“白底板”癥狀的疾病流行廣、危害嚴(yán)重［1］，被養(yǎng)鱉者稱之為“不治之癥”。這些疾病的研究報道較多，發(fā)現(xiàn)的病原有病毒［2］、細(xì)菌［3-4］、細(xì)菌與病毒的混合感染［5-6］、非寄生性病因［7］等，有學(xué)者提出了一些治療及預(yù)防方法［4-5，8］，但均未取得理想效果。患病中華鱉表現(xiàn)出“白底板”是一種典型的全身缺血的腹面臨床癥狀，牟群等［1］和潘連德等［7，9］研究發(fā)現(xiàn)，“白底板”癥狀并不是一種寄生性疾病，僅僅根據(jù)其癥狀來命名的中華鱉“白底板”病，值得商榷，有關(guān)該病的病原、病理、診斷與控制目前尚不明確。浙江杭州是中國集約化養(yǎng)殖中華鱉的主產(chǎn)區(qū)，溫室養(yǎng)殖模式的產(chǎn)量占據(jù)較大市場分量，幾年來，筆者對其跟蹤診斷與控制研究發(fā)現(xiàn)，具有“白底板”癥狀的疾病依然是危重病害，給中華鱉生產(chǎn)造成了嚴(yán)重影響。本研究中，筆者使用常用藥物構(gòu)建具有“白底板”癥狀的中華鱉藥源性肝病動物模型，研究該病的病因、病理過程以及病理機(jī)制和病理轉(zhuǎn)歸等問題，旨在為正確診斷具有“白底板”癥狀的疾病和預(yù)防與控制中華鱉藥源性肝病提供科學(xué)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

預(yù)試驗(yàn)用健康中華鱉稚鱉50 只，體質(zhì)量為10 g;正式試驗(yàn)用健康中華鱉稚鱉640 只，體質(zhì)量為5 ～10 g，均取自上海某中華鱉養(yǎng)殖場。

飼料為常興牌稚鱉料。諾氟沙星、土霉素、氯霉素購自上海五洲藥廠孫橋分廠。

1.2 方法

1.2.1 預(yù)試驗(yàn)在實(shí)驗(yàn)室條件下(室溫25 ℃)，共設(shè)10 組，其中1 組投喂添加10 g/kg 氯霉素的飼料;4 組分別投喂添加5、10、20、30 g/kg 土霉素的飼料;4 組分別投喂添加5、10、20、30 g/kg 諾氟沙星的飼料;1 組為空白對照組，投喂不添加任何藥物的稚鱉料。每組放5 只中華鱉，在直徑為70 cm 的塑料盆中養(yǎng)殖，盆底鋪黃沙5 cm，手工制作藥餌，以飼養(yǎng)20 ～30 d 出現(xiàn)陽性樣品為參照。預(yù)試驗(yàn)結(jié)果表明，投喂諾氟沙星的組在添加濃度為5 g/kg時陽性癥狀出現(xiàn)時間少于20 d，結(jié)合生產(chǎn)用藥濃度，確定試驗(yàn)組出現(xiàn)“白底板”癥狀陽性個體的藥物添加濃度分別為諾氟沙星2 ～3 g/kg、土霉素10 ～20 g/kg，氯霉素為陽性對照。

1.2.2 藥餌的制作和養(yǎng)殖試驗(yàn)條件 正式試驗(yàn)中，諾氟沙星添加量為2 g/kg(飼料)，土霉素添加量為10 g/kg(飼料)，按此比例手工將藥物和粉末飼料稱重、混合均勻后，加水揉成團(tuán)狀，兩種藥餌一次加工供5 d 的飼用量，放入冰箱(4 ℃)中保存。

正式試驗(yàn)在上海某中華鱉溫室養(yǎng)殖車間進(jìn)行。選上層4 口池，每個池中間用60 目篩絹隔開，共分成8 個養(yǎng)殖池，依次編號為1#～8#，車間控溫在(28 ±2)℃，日糧、換水與生產(chǎn)車間同步。將健康稚鱉640 只，隨機(jī)分為8 組投放到8 個養(yǎng)殖池中。

1.2.3 用兩種藥物分別構(gòu)建中華鱉藥源性肝病模型 先投喂稚鱉料馴化，待稚鱉正常吃食后再投喂藥餌。1#池為投喂諾氟沙星藥餌組，2#池為投喂不加藥物餌料而池水相通的對照組;3#池為投喂土霉素藥餌組，4#池為投喂不加藥物餌料而池水相通的對照組;5#～8#池為投喂不加藥物餌料的空白對照組。每7 ～10 d 全量換水一次。每個池日糧為16 ～20 g(投喂量為魚體質(zhì)量的5%)。每天觀察和統(tǒng)計吃食量，檢查稚鱉的健康狀況，監(jiān)測發(fā)病情況。試驗(yàn)陽性樣品出現(xiàn)后，再進(jìn)行以下病理轉(zhuǎn)歸試驗(yàn)。

1.2.4 藥源性肝病轉(zhuǎn)化的動物模型 分別將投喂諾氟沙星藥餌組和土霉素藥餌組中出現(xiàn)“白底板”癥狀食量減少或停食的陽性試驗(yàn)鱉(10 只和5只)，繼續(xù)投喂藥餌，直至死亡。有明顯變化時，按階段固定樣品，留做組織病理切片。

1.2.5 藥源性肝病康復(fù)的動物模型 分別將投喂諾氟沙星藥餌組和土霉素藥餌組中出現(xiàn)“白底板”癥狀食量減少或停食的陽性試驗(yàn)鱉(10 只和5只)，停喂30 d(諾氟沙星組)和20 d(土霉素組)后，改喂沒有添加藥物的稚鱉料，恢復(fù)吃食后，分批固定樣品，留做組織病理觀察。

1.2.6 切片的制作與觀察

1)石蠟切片。根據(jù)臨床解剖的結(jié)果，選擇有代表特征鱉的肝、腎、脾和肺等組織塊，用波恩氏液固定24 h 以上，用常規(guī)石蠟包埋，切片厚度為5 ～6 μm，用H.E 染色，在Olympus BH-2 顯微鏡下觀察并拍照。

2)電鏡超薄切片。在摘取制作石蠟切片組織塊時，同步留取電鏡超薄切片組織塊，切成1 mm3的正方體小塊。用體積分?jǐn)?shù)為2.5%的戊二醛溶液前固定，用0.1 mol/L磷酸緩沖液洗3次，用體積分?jǐn)?shù)為1%的鋨酸后固定，用0.1 mol/L 磷酸緩沖液洗3次。然后經(jīng)五級梯度濃度乙醇脫水(體積分?jǐn)?shù)為50%、70%、80%、90%和95%)，再依次用90%乙醇+丙酮(1∶ 1)以及丙酮+包埋劑(ERL 10 mL、GER 6 mL、NHA 26 mL、GNA 0.4 mL)(1∶ 1)浸透。用包埋劑包埋、模板固定后在60 ℃下烘干，用LKB—8800 超薄切片機(jī)切片，用醋酸雙氧鈾—檸檬酸鉛雙重染色，在JEM100—XⅡ透射電鏡下觀察并拍照。

2 結(jié)果

2.1 藥源性肝病模型陽性(患病)率的統(tǒng)計和臨床解剖特征

受試中華鱉出現(xiàn)“白底板”癥狀時，確認(rèn)為陽性樣品，即患藥源性肝病鱉。試驗(yàn)開始38 d 時諾氟沙星組最先出現(xiàn)陽性樣品，試驗(yàn)進(jìn)行52 d 后清池和統(tǒng)計，諾氟沙星組陽性率最高，達(dá)31.3%(25 只/80 只，1#);土霉素組陽性樣品出現(xiàn)較諾氟沙星組晚，陽性率略低，為15.0%(12 只/80 只，3#);與池水相通的對照組(2#和4#)由于受藥毒的影響也有發(fā)病，但陽性率較低，分別為10.0%(8 只/80 只，2#)和5.0%(4 只/80 只，4#)，證實(shí)1#和3#的殘餌中或代謝物中的藥毒通過流通的水分別進(jìn)入2#和4#池，使對照組中華鱉受到毒害;空白對照組(5#～8#)未出現(xiàn)陽性樣品。

對模型陽性樣品的中華鱉臨床解剖發(fā)現(xiàn)，患病鱉具有典型的“白底板”癥狀(圖1 -A 5 號鱉、圖1 -C 6 號鱉)，切口無血，內(nèi)臟器官除肝臟外(如腸、胃)嚴(yán)重失血(變白)(圖1 -C 6 號鱉)，肝臟是該病最嚴(yán)重的病變器官，呈紫色(圖1 -B 4 號鱉)或深紅色(圖1 -B 3 號鱉)或白色(圖1 -B 5 號鱉)，腫大(為正常的3 ～4 倍)，表面緊張，切口流出大量深色血液(圖1 - B 2 號鱉)，各樣品的肝臟病變程度有所不同。脾、腎、心、肺等臟器的病理解剖癥狀不明顯。

2.2 藥源性肝病模型陽性中華鱉的組織病理變化

2.2.1 肝組織病理特征 從肝組織病理觀察到1、6、2、3、4、5 號患病中華鱉肝組織病變依次加重，全部患病鱉的肝組織局灶性病變特征明顯，根據(jù)讀片結(jié)果歸納成如下病理變化過程。

1)肝組織炎癥、淤血階段(1 號患病中華鱉)。肝小葉和匯管區(qū)結(jié)構(gòu)顯現(xiàn)異常，肝細(xì)胞索結(jié)構(gòu)有異常，肝細(xì)胞未壞死，血管和血竇內(nèi)血細(xì)胞正常，竇狀隙因擴(kuò)張充血占據(jù)較大空間，肝門靜脈繼續(xù)膨脹，內(nèi)積血液中白細(xì)胞占絕大部分，白細(xì)胞大量貼壁、浸潤肝組織病變區(qū)域，形成明顯炎癥病灶(圖1 -D)。電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，血竇中白細(xì)胞數(shù)量劇增，且核型多變，溶酶體增多(圖1 -E)，肝細(xì)胞內(nèi)脂滴增多增大且連成一片，細(xì)胞核腫脹，核靠邊，核仁分解，線粒體腫脹(圖1 -F)。

2)肝組織淤血加劇、肝細(xì)胞索混亂、肝細(xì)胞壞死階段(6 號患病中華鱉)。肝小葉和匯管區(qū)結(jié)構(gòu)顯現(xiàn)異常加劇，血竇繼續(xù)擴(kuò)張、結(jié)構(gòu)完整、淤血加劇，竇狀隙因擴(kuò)張充血而占據(jù)更大空間，肝細(xì)胞索混亂且萎縮，肝細(xì)胞壞死呈空泡化，血管和血竇內(nèi)血細(xì)胞正常，肝靜脈血管壁增厚，炎性細(xì)胞散布于肝組織，未見明顯炎癥灶(圖1 -G)。電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，肝血竇中白細(xì)胞擠壓紅細(xì)胞，白細(xì)胞核型多變(圖1 -H)，肝血竇擠壓肝細(xì)胞，使肝細(xì)胞形狀發(fā)生變化，細(xì)胞核腫大，細(xì)胞內(nèi)高爾基、線粒體腫脹，結(jié)構(gòu)模糊不清(圖1 -I)。

3)肝組織血腫、血竇擴(kuò)張、肝細(xì)胞壞死階段(2 號患病中華鱉)。肝小葉和匯管區(qū)結(jié)構(gòu)模糊，血竇繼續(xù)擴(kuò)張、結(jié)構(gòu)完整、淤血加劇，竇狀隙占據(jù)更大空間，肝細(xì)胞索混亂且萎縮，肝細(xì)胞壞死呈空泡化(圖1 -J)，血管和血竇內(nèi)血細(xì)胞變性，肝靜脈血管壁增厚，炎性細(xì)胞散布于肝組織，未見明顯炎癥灶(圖1 -K)。

4)肝組織壞死、血竇繼續(xù)擴(kuò)張、竇壁破裂、肝細(xì)胞索破碎、肝細(xì)胞壞死、匯管區(qū)變性階段(3號和4 號患病中華鱉)。肝小葉和匯管區(qū)結(jié)構(gòu)消失，肝細(xì)胞索破碎、消失，肝細(xì)胞壞死呈空泡化，血竇繼續(xù)擴(kuò)張、竇壁破碎，散布于肝組織中，血細(xì)胞發(fā)生輕微變性，肝靜脈血管壁增厚，炎性細(xì)胞散布于肝組織，未見明顯炎癥灶(圖1 -L)。

5)肝組織接近硬化壞死、血細(xì)胞壞死和血漿變性階段(5 號患病中華鱉)。肝靜脈血管壁增厚(圖1 -M)，肝組織基本結(jié)構(gòu)已經(jīng)難以辨認(rèn)，肝細(xì)胞壞死，細(xì)胞膜已經(jīng)模糊不清(圖1 -N)，散布于組織中的血細(xì)胞變性，可見紅細(xì)胞核膨脹、胞漿固縮，炎性細(xì)胞也有相似變性(圖1 -O)。

2.2.2 腎、脾、肺組織病理特征 肺(1 號患病鱉):各陽性樣品的肺組織結(jié)構(gòu)正常，肺泡上皮細(xì)胞有嗜酸性粒細(xì)胞浸潤，未形成炎癥灶(圖1 -P)。

脾(1 號和5 號患病鱉):遍布在整個脾臟組織中的炎性細(xì)胞浸潤，形成明顯炎癥灶，紅髓中的脾索和脾竇難以區(qū)分，白髓中出現(xiàn)大量紅細(xì)胞，脾小體界限不清(圖1 -Q)，白髓和紅髓交界處可以觀察到許多粒細(xì)胞，基本結(jié)構(gòu)正常(圖1 -R)。

腎(1 號和5 號患病鱉):腎外側(cè)區(qū)的腎小管有炎性細(xì)胞浸潤，形成明顯炎癥灶，部分近端小管、集合管、遠(yuǎn)端小管的上皮細(xì)胞發(fā)生空泡化變性壞死(圖1-S)，內(nèi)側(cè)區(qū)腎小球球囊腔擴(kuò)張，腔內(nèi)充有泡沫狀物質(zhì)，嗜酸性粒細(xì)胞散布腎組織中(圖1-T)。

圖1 中華鱉藥源性肝病組織病理解剖和組織學(xué)觀察Fig.1 The pathological anatomy and histological observation of liver，lung，spleen and kidney in drug－induced liver diseased soft－shell turtle

續(xù)圖1 中華鱉藥源性肝病組織病理解剖和組織學(xué)觀察Cont.Fig.1 The pathological anatomy and histological observation of liver，lung，spleen and kidney in drug－induced liver diseas soft－shelled turtle

2.3 藥源性肝病的轉(zhuǎn)歸

對陽性鱉繼續(xù)用藥餌飼喂，“白底板”癥狀逐漸明顯，病情加重，第17 d 陸續(xù)開始死亡，試驗(yàn)30 d 時受試鱉全部死亡。

對陽性鱉停喂藥餌，停喂30 d(諾氟沙星組)和20 d(土霉素組)后，鱉開始恢復(fù)進(jìn)食，逐步進(jìn)入康復(fù)狀態(tài)，恢復(fù)進(jìn)食40 d 后試驗(yàn)鱉均出現(xiàn)健康鱉的底板色，表明當(dāng)致病因素(大劑量藥物餌料)撤銷后，中華鱉有較強(qiáng)的恢復(fù)性，并表現(xiàn)出土霉素組較諾氟沙星組康復(fù)的快，康復(fù)之后中華鱉5月齡后放入池塘繼續(xù)飼養(yǎng)。

3 討論

3.1 中華鱉藥源性肝病模型構(gòu)建的意義

藥源性疾病具有很強(qiáng)的隱蔽性，而其危害性至今尚未引起廣大醫(yī)務(wù)工作者重視，使得對藥源性肝病及其診斷和治療知之甚少［10］。中華鱉的藥源性肝病正是由于這種原因，常常得不到準(zhǔn)確的診斷。本試驗(yàn)在生產(chǎn)車間條件下，試驗(yàn)樣品640 只，試驗(yàn)全程達(dá)到150 d，成功構(gòu)建了中華鱉藥源性肝病及其轉(zhuǎn)化模型，充分證明了長期高劑量使用抗生素會導(dǎo)致中華鱉患上具有典型“白底板”癥狀的藥源性肝病。本研究為水產(chǎn)動物醫(yī)學(xué)的非病原性疾病模型的研究奠定了基礎(chǔ)。

康復(fù)試驗(yàn)開始時的中華鱉通過病理解剖和組織病理觀察，發(fā)現(xiàn)其病情已經(jīng)發(fā)展到肝淤血至肝血腫階段，停止用藥后可恢復(fù)到健康狀態(tài)，表明在肝淤血階段及輕度的肝血腫階段，藥源性肝病是可以康復(fù)的，具有一定可逆性。發(fā)現(xiàn)病變后及時、準(zhǔn)確地診斷，查明原因，將致病因子消除即可痊愈。養(yǎng)殖期間常用保肝健脾的中藥制劑，可起到預(yù)防效果［11-14］，還可借鑒家畜、家禽集約化養(yǎng)殖的“限飼飼養(yǎng)”方法進(jìn)行預(yù)防。

3.2 藥物致中華鱉肝組織損害的組織病理過程

中華鱉藥源性肝病按臨床分類屬于中毒性肝損傷。從中華鱉藥源性肝病模型可以清楚地了解疾病產(chǎn)生的整個組織病理變化過程，中華鱉在長期受到大量抗生素藥物的刺激下，肝臟負(fù)擔(dān)過重、中毒，造成嚴(yán)重的肝損傷;致病因子持續(xù)作用脂肪變性更加嚴(yán)重，引起肝組織炎癥［15-16］和淤血;出現(xiàn)血腫與出血;肝細(xì)胞的空泡化變性、壞死，肝血竇竇壁破裂，趨于肝硬變和肝性腹水，這一系列組織病理過程導(dǎo)致肝功能衰竭，患病鱉死亡。高劑量、長時間使用抗生素類藥物是中華鱉藥源性肝病的致病原因，臨床表現(xiàn)為“白底板”癥狀。

3.3 中華鱉藥源性肝病的診斷和肝損害的預(yù)防

藥源性肝損害是引起肝功能障礙的常見原因，占整個藥物不良反應(yīng)的10%左右。長期低劑量攝取的藥餌中，對肝臟損傷嚴(yán)重的有磺胺類、抗生素藥物、有機(jī)氯殺蟲劑［17-18］和化學(xué)合成物質(zhì)［19］。此外，礦 物 質(zhì)(Cd、Pb、Cu等)［20］、維 生 素(Ve)［21］、激素，以及含亞硝酸鹽高的飼料［22］、黃曲霉素的飼料［23-24］和氧化魚油［25］等都會造成肝臟損傷或影響肝功能，出現(xiàn)非寄生性疾病。

藥源性肝病與其他原因所致的肝病不易區(qū)別，給診斷帶來一定困難。調(diào)查疾病原因時要問清養(yǎng)殖過程中給藥情況以及給藥種類、劑量、時間等，發(fā)現(xiàn)有重癥的個體要及早停藥，進(jìn)行全面檢查，查明致病的準(zhǔn)確病因，給予正確的診斷。中華鱉藥源性肝病具有典型的“白底板”癥狀，病理解剖特征是肝淤血、血腫和硬化，組織病理特征是炎癥、淤血、肝細(xì)胞壞死、血細(xì)胞壞死，這些都可作為診斷依據(jù)。藥源性肝病屬于中華鱉非寄生性疾病的一種［7］，不能診斷為中華鱉“白底板”病。

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