楊志平，孫飛雪，劉志明，張磊，曹為，馬悅欣

(1.大連匯新鈦設(shè)備開發(fā)有限公司，遼寧 大連116039;2.大連海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連116023)

刺參Apostichopus japonicus是中國北方地區(qū)重要的海珍品之一，具有很高的營養(yǎng)價值和經(jīng)濟(jì)價值。隨著刺參養(yǎng)殖密度的增加以及海水污染程度的惡化，各種傳染性疾病也隨之出現(xiàn)，給刺參養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失［1-4］。傳統(tǒng)的疾病防治方法以使用抗生素為主，容易使細(xì)菌產(chǎn)生抗藥性［5］，干擾水生動物腸道正常微生物區(qū)系［6］，還可能造成水產(chǎn)品中藥物殘留，對人類健康產(chǎn)生不利影響。已有研究表明，從健康動物體內(nèi)分離具有產(chǎn)酶能力的微生物是篩選益生菌的有效途徑［7-8］。潛在益生菌對刺參生長、消化、免疫的影響研究已有報道［9-12］。本研究中，作者從自然海域生長的健康刺參腸道組織篩選出幾株產(chǎn)多種水解酶的細(xì)菌，并對其進(jìn)行安全性試驗(yàn)和初步分類鑒定，旨在為刺參益生菌制劑的研發(fā)與應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用刺參樣品于2010年5月和2010年11月分別采自大連柏嵐子和黑石礁自然海域，體質(zhì)量為10 ～30 g，共20 頭。

1.2 方法

1.2.1 腸道細(xì)菌分離 將從海底取回的新鮮刺參以無菌解剖法取出腸道，在低溫下將組織勻漿，并與適量的無菌海水充分混勻，稀釋，取適宜的稀釋液0.1 mL 涂布于TSA和MRS 培養(yǎng)基上，在20 ℃下恒溫培養(yǎng)2 ～3 d，選取形態(tài)不同的菌落經(jīng)劃線純化后接種于2216E 斜面上，并于4 ℃下保存。

1.2.2 菌株的產(chǎn)酶能力測定在淀粉培養(yǎng)基、海水酪素瓊脂培養(yǎng)基、脂酶(Tween80)培養(yǎng)基以及產(chǎn)纖維素酶培養(yǎng)基上采用點(diǎn)種法測定菌株的產(chǎn)酶能力，以水解圈直徑與菌落直徑之比初步判定產(chǎn)酶能力。使用TSB 培養(yǎng)基對初篩菌株產(chǎn)酶進(jìn)行定量測定，將菌株在TSB 中培養(yǎng)24 h 獲得種子培養(yǎng)物，再將液體種子以2%的接種量接種于50 mL 液體培養(yǎng)基中，在25 ℃下?lián)u瓶(150 r/min)培養(yǎng)48 h，以3 000 r/min 離心15 min，取上清液測定酶活力。采用淀粉-碘比色法測定淀粉酶活力，采用福林酚試劑法測定蛋白酶活力。

1.2.3 細(xì)菌溶血試驗(yàn) 將用TSA 培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)的待測菌株點(diǎn)種羊血平板，于20 ℃下培養(yǎng)24 h，根據(jù)菌落周圍透明圈的形成來判斷溶血素的產(chǎn)生。

1.2.4 安全性試驗(yàn) 將刺參(1 ～2 g)飼養(yǎng)在盛70 L 過濾海水的100 L 塑料桶中，水溫約14 ℃，暫養(yǎng)2 周。將80 頭健康的刺參隨機(jī)分為8 組，每組10 頭，其中1 組刺參腹腔注射0.1 mL 濃度為107cfu/mL 的待測菌株菌液，1 個對照組注射等量的無菌生理鹽水;3 組刺參每天投喂含細(xì)菌濃度為109cfu/g 的干飼料，3 個對照組刺參每天投喂基礎(chǔ)飼料。飼料配方(干物質(zhì)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)):豆粕10%，魚粉8%，馬尾藻25%，脫膠海帶粉30%，麥飯石10%，石粉16.5%，多維預(yù)混料0.5%，其營養(yǎng)成分:粗蛋白質(zhì)16.32%，粗脂肪5.53%，粗纖維16.13%，粗灰分30.78%。試驗(yàn)期間每天按刺參體質(zhì)量的5%投喂，每2 d 換水1/2 并吸底去除殘餌及糞便。觀察和記錄一個月試驗(yàn)中刺參的發(fā)病和死亡情況。

1.2.5 菌株的鑒定 細(xì)菌DNA 的提取方法參考文獻(xiàn)［13］，用引物對27f/1492r［14］對提取的DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，50 μL 反應(yīng)體系包含:5 μL 10 ×PCR Buffer，4 μL dNTPs，4 μL MgCl2(25 mmol/L)，上、下游引物(10 mmol/L)各2 μL，1.25 U Taq 酶，4 μL DNA 模板，28.75 μL ddH2O。反應(yīng)程序?yàn)?94 ℃下預(yù)變性4 min;94 ℃下變性30 s，56 ℃下退火30 s，72 ℃下延伸90 s，共進(jìn)行30 個循環(huán);最后在72 ℃下再延伸10 min。用10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產(chǎn)物，將PCR 產(chǎn)物送天根生化科技有限公司進(jìn)行測序。

2 結(jié)果

2.1 刺參腸道細(xì)菌的產(chǎn)酶能力

從表1可見:從取自大連柏嵐子海域刺參腸道分離出的13 株細(xì)菌(BC11 ～BC113)中，4 株無產(chǎn)酶能力，6 株產(chǎn)1種酶，3 株產(chǎn)2種酶;從黑石礁海域刺參腸道分離的37 株細(xì)菌(BC21 ～BC237)中，8 株無產(chǎn)酶能力，6 株產(chǎn)1種酶，10株產(chǎn)2種酶，12 株產(chǎn)3種酶，1 株產(chǎn)4種酶。

依據(jù)酶活力定性檢測結(jié)果選出其中9 株菌進(jìn)行酶活力測定，結(jié)果表明:淀粉酶活力為203.0 ～860.2 U/mL，其中BC28 菌株和BC210 菌株的淀粉酶活力最高;蛋白酶活力為65.9 ～148.7 U/mL，其中BC222和BC225 菌株的蛋白酶活力最高。

2.2 細(xì)菌溶血試驗(yàn)

依據(jù)產(chǎn)酶結(jié)果選 BC26、BC222、BC225、BC228、BC232和BC234 菌株進(jìn)行溶血試驗(yàn)，結(jié)果6 株菌均不產(chǎn)生溶血素，但BC222、BC225和BC234 菌株產(chǎn)生α 溶血。

表1 刺參腸道菌株的產(chǎn)酶能力Tab.1 Qualitative extracellular enzyme activity of the bacterial strains isolated from the gut of sea cucumber

2.3 安全性試驗(yàn)

選用細(xì)菌BC26、BC228和BC232 菌株對刺參進(jìn)行安全性試驗(yàn)，無論給刺參腹腔注射細(xì)胞濃度為107cfu/mL 的BC26、BC228、BC232 菌懸液，還是投喂含細(xì)菌濃度為109cfu/g 的干飼料，養(yǎng)殖一個月后，試驗(yàn)組和對照組刺參均無發(fā)病和死亡現(xiàn)象。表明3 株細(xì)菌在試驗(yàn)濃度下對刺參無毒力。

2.4 菌株的鑒定

將BC26、BC228和BC232 菌株的16S rDNA序列用Blast 軟件在GenBank 數(shù)據(jù)庫(www.ncbi.nlm.nih.gov)中進(jìn)行檢索，調(diào)取相似性最高的序列。檢測結(jié)果顯示:BC26、BC228和BC232 菌株分別與芽孢桿菌Bacillus sp.FA132(JQ083325)、假交替單胞菌Pseudoalteromonas sp.NBRC102016(AB681663)和塔斯馬尼亞弧菌Vibrio tasmaniensis 04102(AM422801)的相似性均為99%。

3 討論

國內(nèi)外學(xué)者研究證明，魚類、貝類腸道中普遍存在產(chǎn)酶細(xì)菌［15-18］。王瑞旋等［15］對軍曹魚腸道異養(yǎng)細(xì)菌進(jìn)行一周年的監(jiān)測，分離得到94 株優(yōu)勢菌，并檢測其產(chǎn)蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶的能力，結(jié)果顯示，有8 株菌能同時分泌這3種酶。Bairagi等［16］對9種淡水魚消化道產(chǎn)淀粉酶、纖維素酶、脂肪酶和蛋白酶的細(xì)菌進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，從不同種魚的腸道可分離出不同的產(chǎn)酶細(xì)菌。祝玲等［17］從近江牡蠣腸道中分離出21 株菌，并對其蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纖維素酶的產(chǎn)酶能力進(jìn)行測定，結(jié)果表明，產(chǎn)3種酶以上的有8 株菌。王志等［18］研究發(fā)現(xiàn)，在九孔鮑消化道中存在著能分泌蛋白酶、脂肪酶和纖維素酶的微生物。這些研究證明，魚類、貝類腸道除了內(nèi)在的消化酶外，還有獨(dú)特的細(xì)菌源消化酶，包括淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶和纖維素酶［15-18］，這有助于營養(yǎng)學(xué)家將產(chǎn)酶細(xì)菌作為益生菌，設(shè)計(jì)出低成本飼料配方。本試驗(yàn)中從刺參腸道分離出50 株細(xì)菌，其中產(chǎn)3種酶以上的細(xì)菌13 株，表明由腸道細(xì)菌補(bǔ)充刺參消化酶的可能性。Bairagi等［16］對從不同淡水魚腸道分離出的其中10 株產(chǎn)酶細(xì)菌進(jìn)行酶活力測定，其蛋白酶活力為1.6 ～23.8 U/mL。王福強(qiáng)等［19］從牙鲆腸道分離出25 株產(chǎn)蛋白酶的細(xì)菌，篩選出4 株產(chǎn)酶活力較高的菌株，其酶活力為2.19 ～4.47 U/mL。本研究中對從刺參腸道分離出的其中9 株產(chǎn)酶細(xì)菌進(jìn)行酶活力測定，其蛋白酶活力為65.9 ～148.7 U/mL，高于從魚類腸道分離出菌株的酶活力［15，19］。

在篩選潛在益生菌時，一般通過小規(guī)模體內(nèi)試驗(yàn)檢測候選菌株對宿主的致病性［20-22］。Kim等［20］從虹鱒腸道分離出Carnobacterium maltaromaticum B26 菌株和廣布肉桿菌Carnobacterium divergens B33菌株，經(jīng)腹腔注射、肌肉注射B26 菌株和B33 菌株的菌懸液以及投喂含二菌株的飼料對魚體均無毒力。Aly等［21］給尼羅羅非魚腹腔注射和肌肉注射從養(yǎng)魚塘分離的Bacillus pumilus 菌株后魚未出現(xiàn)發(fā)病和死亡現(xiàn)象。Abd El -Rhman等［22］通過給魚體腹腔注射從尼羅羅非魚的性腺和腸道分離的藤黃微球菌Micrococcus luteus 證明該菌株是安全的。本試驗(yàn)中，通過給刺參腹腔注射BC26、BC228和BC232菌株的菌懸液和投喂含3 菌株的飼料證明這些菌株是安全的。

Macey等［7］依據(jù)蛋白質(zhì)和淀粉的降解能力從鮑魚消化道篩選出潛在益生菌，在鮑魚的養(yǎng)殖過程中投喂含此菌的飼料，結(jié)果與投喂不含菌的飼料組比較，試驗(yàn)組鮑魚的生長率和存活率均有明顯提高，其腸道中的蛋白酶活力也有明顯增加。Bairagi等［8］在南亞野鯪Labeo rohita 的飼料中添加魚腸道菌枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis和環(huán)狀芽孢桿菌B.circulans，結(jié)果魚的生長、食物轉(zhuǎn)化率和蛋白質(zhì)效率增加，他們將這歸因于由細(xì)菌產(chǎn)生的胞外纖維素和淀粉水解酶。周慧慧等［10］發(fā)現(xiàn)自刺參腸道分離的潛在益生菌Bacillus sp.GSC-1和Enterococcus sp.GSC-3可使稚參成活率、特定生長率和變色率顯著提高。用添加外源或內(nèi)源的枯草芽孢桿菌飼料投喂刺參，其生長和免疫力顯著提高［11，23］。本研究中依據(jù)產(chǎn)酶能力、溶血試驗(yàn)和對刺參的安全性試驗(yàn)篩選出3 株對刺參無害的細(xì)菌，在刺參的養(yǎng)殖過程中投喂含菌飼料，可明顯促進(jìn)刺參的生長和抗病力，其結(jié)果將另文發(fā)表。

［1］馬悅欣，徐高蓉，常亞青，等.大連地區(qū)刺參幼參潰爛病細(xì)菌性病原的初步研究［J］.大連水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報，2006，21(1):13 -17.

［2］馬悅欣，徐高蓉，張恩鵬，等.仿刺參幼參急性口圍腫脹癥的細(xì)菌性病原［J］.水產(chǎn)學(xué)報，2006，30(3):378 -382.

［3］王印庚，榮小軍，張春云，等.養(yǎng)殖海參主要疾病及防治技術(shù)［J］.海洋科學(xué)，2005，29(3):1 -7.

［4］Deng H，He C B，Zhou Z C，et al.Isolation and pathogenicity of pathogens from skin ulceration disease and viscera ejection syndrome of the sea cucumber Apostichopus japonicus［J］.Aquaculture，2009，287:18 -27.

［5］Sahul Hameed A S，Rahaman K H，Alagan A，et al.Antibiotic resistance in bacteria isolated from hatchery-reared larvae and post-larvae of Macrobrachium rosenbergii［J］.Aquaculture，2003，217:39 -48.

［6］Verschuere L，Rombaut G，Sorgeloos P，et al.Probiotic bacteria as biological control agents in aquaculture［J］.Microbiology and Molecular Biology Review，2000，64(4):655 -671.

［7］Macey B M，Coyne V E.Improved growth rate and disease resistance in farmed Haliotis midae through probiotic treatment［J］.Aquaculture，2005，245:249 -261.

［8］Bairagi A，Sarkar Ghosh K，Sen S K，et al.Evaluation of the nutritive value of Leucaena leucocephala leaf meal，inoculated with fish intestinal bacteria Bacillus subtilis and Bacillus circulans in formulated diets for rohu，Labeo rohita(Hamilton)fingerlings［J］.Aquaculture Research，2004，35:436 -446.

［9］張濤，白嵐，李蕾，等.不同添加量的益生菌組合對仿刺參消化和免疫指標(biāo)的影響［J］.大連海洋大學(xué)學(xué)報，2009，24(S1):64-68.

［10］周慧慧，馬洪明，張文兵，等.仿刺參腸道潛在益生菌對稚參生長、免疫及抗病力的影響［J］.水產(chǎn)學(xué)報，2010，34(6):775 -783.

［11］Zhao Y C，Zhang W B，Xu W，et al.Effects of potential probiotic Bacillus subtilis T13 on growth，immunity and disease resistance against Vibrio splendidus infection in juvenile sea cucumber Apostichopus japonicus［J］.Fish ＆ Shellfish Immunology，2012，32:750 -755.

［12］李明，馬悅欣，劉志明，等.刺參機(jī)體酵母菌組成及其拮抗活性的研究［J］.大連海洋大學(xué)學(xué)報，2012，27(5):436 -440.

［13］Zhou J Z，Bruns M A，Tiedje J M.DNA recovery from soils of diverse composition［J］.Microbiology，1996，62(2):316 -322.

［14］Lane D J.16S/23S rRNA sequencing［M］//Nucleic acid Techniques in Bacterial Systematics.New York:John Wiley ＆ Sons，1991.

［15］王瑞旋，馮娟.軍曹魚腸道細(xì)菌及其產(chǎn)酶能力的研究［J］.海洋環(huán)境科學(xué)，2008，27(4):309 -312.

［16］Bairagi A，Sakar Ghosh K，Sen S K，et al.Enzyme producing bacterial flora isolated from fish digestive tracts［J］.Aquaculture International，2002，10:109 -121.

［17］祝玲，楊吉霞，蔡俊鵬，等.近江牡蠣腸道細(xì)菌及其產(chǎn)酶能力［J］.湛江海洋大學(xué)學(xué)報，2005，25(1):10 -13.

［18］王志，蔡俊鵬，徐麗.九孔鮑腸道中產(chǎn)酶菌株的篩選及其與深圳灣菌株的比較［J］.糧食與飼料工業(yè)，2005(5):34 -36.

［19］王福強(qiáng)，陳營，邵占濤，等.牙鲆腸道內(nèi)產(chǎn)蛋白酶菌的分離與篩選［J］.中國微生態(tài)學(xué)雜志，2004，16(5):259 -262.

［20］Kim D H，Austin B.Innate immune responses in rainbow trout(Oncorhynchus mykiss Walbaum)induced by probiotics［J］.Fish＆ Shellfish Immunology，2006，21:513 -524.

［21］Aly S M，Abd-El-Rahman A M，John G，et al.Characterization of some bacteria isolated from Oreochromis niloticus and their potential use as probiotics［J］.Aquaculture，2008，277:1 -6.

［22］Abd El-Rahman A M，Khattab Y A E，Shalaby A M E.Micrococcus luteus and Pseudomonas species as probiotics for promoting the growth performance and health of Nile tilapia，Oreochromis niloticus［J］.Fish ＆ Shellfish Immunology，2009，27:175 -180.

［23］Zhang Q，Ma H M，Mai K S，et al.Interaction of dietary Bacillus subtilis and fructooligosaccharide on the growth performance，nonspecific immunity of sea cucumber，Apostichopus japonicus［J］.Fish＆ Shellfish Immunology，2010，29(2):204 -211.