郝貴杰，潘曉藝，徐洋，姚嘉赟，尹文林，沈錦玉

(浙江省淡水水產研究所，浙江湖州313001)

奧尼羅非魚Oreochromis niloticus×O.aureus是養(yǎng)殖羅非魚的主要品種之一［1-2］。隨著羅非魚養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，羅非魚病害有逐漸增多的趨勢，特別是近年來兩廣地區(qū)及海南省羅非魚養(yǎng)殖中出現(xiàn)了嚴重疾病，其病原主要有海豚鏈球菌Streptococcus iniae和無乳鏈球菌Streptococcus agalactiae［3-7］。另外，多種水生動物病原性鏈球菌已被證明可在高等動物或/和人類間傳播［8-9］。對羅非魚鏈球菌病害的控制目前仍以抗生素為主，長期使用抗生素可誘導耐藥菌產生，破壞養(yǎng)殖水體微生態(tài)環(huán)境，同時抗菌藥物殘留也是影響水產品質量的重要因素。因此，研制疫苗進行預防顯得尤為重要，通過免疫手段有效增強魚體的主動防御能力，減少疾病發(fā)生的機率［10-12］。研究證實，魚類在受到微生物感染或人工免疫后，均能產生由免疫球蛋白(Immunoglobulin，Ig)介導的特異性免疫反應［13］。目前，國內外對羅非魚的菌苗免疫已進行了大量研究［14-17］，但能夠直接反映羅非魚免疫球蛋白提高從而判斷免疫效果的試劑還很缺乏，而針對免疫球蛋白的單抗研究能夠彌補這一缺失。有關羅非魚免疫球蛋白(IgM)的相關研究已有一些報道［18-19］，但有關羅非魚IgM 單克隆抗體(mAb)研制和應用的研究尚未見報道。為此，本研究中作者開展了羅非魚IgM mAb 的制備及其初步應用研究，以期為評價羅非魚鏈球菌滅活疫苗免疫應答水平及規(guī)律提供必要的試劑。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用奧尼羅非魚體質量為500 ～1 000 g，購自湖州某農貿市場。ICR 小鼠和8 周齡雌性BALB/c 小鼠購自浙江大學醫(yī)學院實驗動物中心。

羅非魚無乳鏈球菌L4 由中國水產科學研究院魚病研究室保存，BHI(腦心浸液培養(yǎng)基)購于杭州天和公司，小牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司，高糖型DMEM 及HT、HAT 購自Sigma 公司，HRP 羊抗鼠- IgG、鄰苯二胺(OPD)均購自華美公司，融合用PEG4000 購自Sigma 公司，其他生化試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 免疫原的制備及動物免疫 羅非魚血清IgM 的制備參照文獻［20］，采用飽和硫酸銨沉淀及柱層析方法。用純化的羅非魚血清IgM 免疫小鼠的方法及途徑參照文獻［21 -22］。

1.2.2 細胞融合及陽性雜交瘤細胞株的篩選 按常規(guī)方法［20-21］進行細胞融合，陽性雜交瘤細胞株的篩選參照文獻［20］中的間接ELISA 方法，不同的是包被抗原用提純的羅非魚血清IgM，用免疫小鼠陽性血清做方陣試驗決定包被抗原濃度為10 mg/L。

1.2.3 陽性雜交瘤細胞株的建立及腹水的制備將鑒定為陽性的細胞孔中的細胞擴大培養(yǎng)，并及時凍存，同時根據(jù)有限稀釋法進行亞克隆2 ～3次，至每孔為單細胞克隆及克隆孔陽性率為100%時，即可定株。然后，按照Golding等［23］的方法進行小鼠腹水的制備。

1.2.4 mAb 特性的鑒定

1)mAb 細胞上清及腹水效價。以10 mg/L 純化的羅非魚IgM 包被酶標板，于4 ℃下過夜，封閉后分別加細胞上清和腹水抗體，其中細胞上清的稀釋梯度為1∶ 200 ～1∶ 12 800，腹水的稀釋梯度為1∶ 1 000 ～1∶ 1.024 ×106，每孔加100 μL，其余步驟同文獻［20］中的間接ELISA 方法。

2)mAb 靈敏度的測定。用包被液將提純的羅非魚IgM 稀釋成不同濃度的懸液。IgM 含量從10 mg/L 倍比稀釋到2.25 μg/L，分別取100 μL 加至酶標板各孔，一抗為1 000 倍稀釋的腹水單抗，其余步驟同文獻［20］中的間接ELISA 方法。

1.2.5 Werstern -blot 分析 SDS - PAGE 電泳采用垂直電泳系統(tǒng)，濃縮膠為50 g/L，分離膠為120 g/L。電泳及免疫印跡參考《蛋白質技術手冊》［24］中的方法進行。一抗為1∶ 500 稀釋的單抗腹水，二抗為1∶ 500的羊抗鼠HRP-IgG。

1.2.6 受免羅非魚體液的免疫效果評價

1)菌苗的制備及羅非魚的免疫。羅非魚無乳鏈球菌L4 滅活疫苗的制備參照文獻［25］中的方法，由中國水產科學研究院魚病研究室制備。于試驗前兩周，選取同一批健康的奧尼羅非魚，體質量為40 ～60 g(購自衢州某奧尼羅非魚種苗場)。在過濾的池塘水中充氧飼育，水溫為20 ～22 ℃。試驗共分3 組，每組放45 尾魚，每組均設3 個重復。3 組分別為腹腔注射免疫組(1 ×108cfu/mL，0.1 mL/尾)、浸泡免疫組(5 ×108cfu/mL，用5 L 浸泡5 min)和磷酸鹽緩沖液(PBS，0.01 mol/L，pH 7.2)注射對照組，免疫兩周后加強免疫一次，方法同前。于首次免疫后的不同時間進行尾靜脈采血，每組分別取3 尾，血液于4 ℃冰箱中過夜，以1 500 r/min 離心10 min 分離血清，每組血清混合后于-20 ℃下保存，用于抗體的檢測。

2)建立評價疫苗效果的TAS-ELISA 方法。建立步驟參照文獻［26 -27］中的方法，該方法可簡化為鏈球菌包被→不同稀釋度的免疫魚血清→單抗4B3→HRP 酶標抗鼠二抗→顯色→終止→讀數(shù)。

3)受免羅非魚血清中抗體的測定。每組羅非魚在免疫后14、21、28、35、42、56、70、84、98 d 分別按照上述方法制備血清，用TAS -ELISA方法進行抗體水平以及最高抗體效價的測定。

2 結果

2.1 蛋白質純化結果

采用飽和硫酸銨沉淀及柱層析方法制備奧尼羅非魚IgM，最終收集洗脫峰處的第4 ～8 管蛋白洗脫液，200 μL/管，合并后采用考馬斯亮藍G-250比色法進行蛋白定量。結果表明，純化的羅非魚IgM 的質量濃度為4.2 g/L。

2.2 mAb 的篩選及雜交瘤細胞系的建立

采用羅非魚IgM 免疫小鼠以及細胞融合方法，用間接ELISA 方法檢測細胞培養(yǎng)上清，共獲得6株抗奧尼羅非魚IgM 的細胞株，分別命名為1C10、1C2、1G11、2C2、2F9和4B3，雜交瘤細胞分別經(jīng)3次亞克隆，100%的細胞孔經(jīng)檢測保持了分泌抗羅非魚IgM 的能力，經(jīng)連續(xù)細胞傳代培養(yǎng)后，各細胞株依然能夠穩(wěn)定分泌針對羅非魚IgM 的抗體。

2.3 mAb 的生物學特性

6 株mAb 的細胞培養(yǎng)上清及1G11和4B3 腹水的ELISA 效價結果見表1。

表1 6 株mAb 的生物學特性Tab.1 Biological properties of the six monoclonal antibodies

2.4 mAb 敏感性試驗

用不同濃度的羅非魚IgM 抗原包被ELISA 板，用間接ELISA 法測定單抗4B3 的敏感性。結果表明，該腹水單抗間接ELISA 法檢測羅非魚IgM 的靈敏度為10 μg/L。

2.5 Western－blot 結果

采用SDS-PAGE和Western-blot 方法測定單抗4B3 的特異性，結果見圖1。

圖1 用SDS－PAGE和Western－blot 法對羅非魚IgM抗原性分析的圖譜Fig.1 Identification and specificity of IgM by SDS－PAGE and Western－blot

2.6 免疫奧尼羅非魚的抗體水平

無乳鏈球菌L4 滅活疫苗以不同途徑免疫羅非魚后，每組羅非魚混合血清中抗L4 抗體隨時間的變化如圖2所示，免疫羅非魚最高抗體水平的效價如圖3所示。

圖2 注射及浸泡免疫L4 滅活疫苗后羅非魚血清的抗體水平Fig.2 The sera antibody levels in the tilapia injected by and bathed in inactive vaccine L4

圖3 注射及浸泡免疫L4 滅活疫苗后羅非魚最高抗體水平時的效價(免疫35 d)Fig.3 The peak titer of the antibody in the tilapia injected by and bathed in inactive vaccine L4(35 days after immunization)

3 分析與討論

羅非魚養(yǎng)殖過程中發(fā)生的鏈球菌病害，嚴重影響了該產業(yè)的發(fā)展。而抗生素治療具有較多的負面作用，疫苗的研制及開發(fā)已成為控制該病的一個重要手段。Pasnik等［14］研究了無乳鏈球菌特異性抗體對尼羅羅非魚的被動免疫作用，證實無乳鏈球菌的特異性抗體在羅非魚對無乳鏈球菌的免疫中發(fā)揮主要作用。Shoemaker等［15］研究了利用OraljectTM技術運送海豚鏈球菌凍干口服疫苗免疫羅非魚的效果，結果表明該疫苗對鏈球菌病可提供保護，但較腹腔注射疫苗組效果差些。目前，魚類疫苗的免疫效果多采用傳統(tǒng)的免疫保護力和血清抗體凝集效價進行評估，因為不同魚的免疫球蛋白差異較大，目前也沒有商品化的二抗產品，所以研究羅非魚鏈球菌疫苗免疫效果，闡明羅非魚受免后保護性抗體產生的規(guī)律及水平，制備針對其免疫球蛋白的單抗成為關鍵。本試驗中制備了這一必要的試劑，并做了初步應用。

關于魚類的免疫球蛋白，近年來已開展了較多的研究，一般認為硬骨魚類的免疫球蛋白為IgM，通常魚類的免疫球蛋白是由4 個Ig 分子組成的四聚體，每個Ig 分子由2 個重鏈(H 鏈)和2 個輕鏈(L 鏈)組成，H 鏈相對分子質量一般為60 000 ～81 000，L 鏈相對分子質量一般為20 000 ～30 000［28-30］。不同魚類的IgM 分子存在一定差異，本研究中采用飽和硫酸銨粗提和凝膠分子篩層析方法提純羅非魚免疫球蛋白，經(jīng)SDS -PAGE 電泳分析表明，純化的Ig 的H 鏈、L 鏈分子量大小與報道類似。取適當純化的IgM 免疫小鼠，通過細胞融合以及多次的克隆和篩選，共獲得了穩(wěn)定分泌抗羅非魚IgM mAb 的雜交瘤細胞6 株:1C10、1C2、1G11、2C2、2F9和4B3。Western -blot 試驗結果表明，mAb 4B3是針對羅非魚Ig 分子重鏈的。這與作者之前制備的草魚免疫球蛋白單抗針對其重鏈的結果相似［20］，這是因為魚的血清Ig 分子與脊椎動物的IgM 分子相似，重鏈的恒定區(qū)氨基酸序列多，結構復雜，可提供多個抗原結合表位;而輕鏈就相對簡單，其上免疫表位少，所以強陽性的單抗細胞株絕大多數(shù)是抗IgM 重鏈的，在單抗篩選過程中針對輕鏈的雜交瘤細胞很容易丟失和放棄。已報道的抗魚類Ig 的單抗也是多數(shù)只可以識別魚的Ig重鏈，僅有少量針對輕鏈［31］。用不同濃度的羅非魚IgM 抗原包被ELISA 板，用間接ELISA 法測定4B3 的敏感性，結果表明，該單抗間接ELISA 法檢測羅非魚IgM 的靈敏度為10 μg/L，這種高靈敏性的mAb 為羅非魚傳染性疾病的免疫學研究和血清學調查提供了可靠的試劑。

本研究中利用所制備的單抗，建立了以單抗4B3 為核心的三抗體ELISA 方法(TAS -ELISA)，并用該方法評價了在實驗室開展的無乳鏈球菌L4滅活疫苗免疫羅非魚的免疫效果，實驗室免疫羅非魚選擇腹腔注射和浸泡免疫方式。結果表明，羅非魚免疫14 d 后，受免魚血清抗L4 的抗體比對照組稍有增加，進行加強免疫后，也就是在首次免疫21 d 后，兩種免疫方式的魚血清抗L4 的抗體均有明顯增加，免疫35 d 后增加更為顯著，達到最高峰，但免疫56 d 后抗體開始下降，直到第98天還維持在明顯高于對照組的抗體水平。羅非魚免疫35 d 時，注射免疫產生的抗體效價達1∶ 2 560，浸泡免疫產生的抗體效價達1∶ 640，可見羅非魚注射免疫效果要優(yōu)于浸泡免疫，但浸泡免疫具有操作方便、對魚體損傷小的優(yōu)勢，這些結果為羅非魚無乳鏈球菌滅活疫苗的中試及示范奠定了基礎。

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