楊威，張峰，馬志，鄭俊峰

(大連海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連116023)

在人體免疫通路中，補(bǔ)體蛋白C3在細(xì)菌或炎灶分解產(chǎn)物的作用下裂解出C3c，C3c是一種參與免疫激活通路中必不可少的蛋白。但是C3c 多度表達(dá)會(huì)引發(fā)諸多復(fù)雜疾病或癥狀，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、重癥肌無力、肺出血和腎炎綜合征等疾病，以及異種移植超急性排斥反應(yīng)等癥狀。目前，幾種C3 補(bǔ)體的抑制劑仍處于研發(fā)狀態(tài)，尚未在臨床試驗(yàn)中應(yīng)用［1-10］。研發(fā)內(nèi)容以CR1(補(bǔ)體受體)補(bǔ)體活化調(diào)節(jié)劑以及對(duì)其進(jìn)行修飾的研究居多，但其結(jié)果對(duì)一些疾病的療效卻不盡如人意。近年來發(fā)現(xiàn)的小分子補(bǔ)體抑制劑與上述傳統(tǒng)生物大分子相比，在藥物方式、藥物動(dòng)力學(xué)方面均有許多優(yōu)點(diǎn)。Morikis等［11］認(rèn)為，C3 結(jié)合肽(Compstatin)可能會(huì)通過抑制劑C3 轉(zhuǎn)化酶(C3bBb)的形成和降低C3 轉(zhuǎn)化酶的穩(wěn)定性來抑制C3 的活化，但最新研究［12-13］推測(cè)，它是通過結(jié)合到C3 分子的C3c 部分來阻止C3 裂解成C3a和C3b，從而抑制C3 的活化。Compstatin是一種帶13 個(gè)氨基酸(ICVVQDWGHHRCT-NH2，在Cys-2-Cys-12 有二硫鍵)的環(huán)狀纖維蛋白多肽(圖1)，它可以有效抑制C3 裂解反應(yīng)中C3 轉(zhuǎn)變成C3b，使之轉(zhuǎn)變成C3c-Compstatin 復(fù)合物，以阻止C3b 進(jìn)一步與自身物質(zhì)——抗體結(jié)合而提供強(qiáng)烈的清除自身靶點(diǎn)復(fù)合物的信號(hào)。Compstatin 因具有抑制效果明顯、分子量小和非免疫原性等特點(diǎn)［14］，已經(jīng)成為一種新的補(bǔ)體抑制劑潛藥。目前，Compstatin 與C3 蛋白結(jié)合的機(jī)制尚不明確，因此，進(jìn)一步研究Compstatin 與C3蛋白的結(jié)合十分必要。本研究中將針對(duì)C3c 蛋白與抑制劑的結(jié)合進(jìn)行模擬研究。

1 模型與計(jì)算方法

1.1 C3c-Compstatin 的結(jié)構(gòu)與模型的選取

由于酶的變構(gòu)抑制效應(yīng)，Compstatin在水溶液中的自由狀態(tài)與在結(jié)合于C3 上的狀態(tài)不同。本研究中，復(fù)合物初始結(jié)構(gòu)為C3c-Compstatin 的結(jié)晶結(jié)構(gòu)(PDB ID 2qki)取自于蛋白質(zhì)庫(http://www.rcsb.org/pdb/)，分辨率為2.4 ?，C3c是C3主要的多肽片段，它由β 鏈(23 ～665 個(gè)氨基酸)巨球蛋白域MG1 ～MG7、α 鏈(749 ～936)錨定區(qū)域anchor、α 鏈(1321 ～1663)C345c 區(qū)域組成，其中與抑制劑Compstatin 結(jié)合的是β 鏈上的MG 巨球蛋白域中的MG4 ～MG5 區(qū)域，因?yàn)閭?cè)鏈anchor和C345c 區(qū)域遠(yuǎn)離配體結(jié)合位點(diǎn)，為了節(jié)省計(jì)算時(shí)間和資源，模型不包括α 鏈(749 ～936)錨定區(qū)域anchor和α 鏈(1321 ～1663)C345c 區(qū)域。利用分子動(dòng)力學(xué)方法補(bǔ)齊結(jié)晶體缺失的殘基后，制成分子動(dòng)力學(xué)的輸入文件。

1.2 分子動(dòng)力學(xué)模擬

分子動(dòng)力學(xué)模擬采用Amber 11 程序包中的Sander 及Pmemd 模塊［15］，受體和配體蛋白全部采用ff99［16］力場。若把整個(gè)體系放入水中，總原子數(shù)將超過Amber 11 程序能夠允許的范圍，并且在模擬準(zhǔn)確性下降的同時(shí)還會(huì)嚴(yán)重影響計(jì)算機(jī)模擬的時(shí)間，為此，采用在距抑制劑Compstatin 質(zhì)心2.0 nm 的復(fù)合物上包一個(gè)“水帽”(solvate cap)的方式加水。水溶液采用顯性的TIP3P 模型，為了使整個(gè)系統(tǒng)總體電荷為0，添加了1 個(gè)鈉離子，分子動(dòng)力學(xué)初始結(jié)構(gòu)如圖2所示。用SHAKE 法來限制所有含氫鍵的伸縮［17］，模擬步長取2 fs。非鍵相互作用的截?cái)嘀?Cutoff)為1.2 nm，在運(yùn)行分子動(dòng)力學(xué)之前，根據(jù)Ryckaert等［17］的研究結(jié)果，先用5 000 步最陡下降法(steepest descent method)，緊接著用5 000 步共軛梯度法(conjugate gradient)來消除分子間的高能碰撞;然后約束溶質(zhì)部分，設(shè)定所有水分子及抗衡離子可以移動(dòng)，將體系升溫到300 K，使其在密度為1 g/cm3時(shí)保持平衡;取消溶質(zhì)約束，利用NTP 系宗進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬，產(chǎn)生10 ns 的生產(chǎn)相軌跡，只對(duì)后1 ns 平衡構(gòu)象進(jìn)行采樣，每2 ps 取一次構(gòu)象，利用采集的構(gòu)象進(jìn)行自由能計(jì)算。

1.3 自由能的計(jì)算公式

采用Amber 11 程序包中的mm_ pbsa.py 模塊，使用 MM/PBSA 方法計(jì)算結(jié)合自由能△G［18-21］，其計(jì)算公式為

其中:△GMM為分子真空下的內(nèi)能差，通過分子力學(xué)方法獲得，包括真空靜電相互作用能△GELE和真空范德華作用能△GVDW;△S 為通過正則模擬方法計(jì)算獲得的熵變;T 為絕對(duì)溫度;△GSOLVE為溶劑化自由能差;△GPB為通過求解Poisson-Boltzmann方程［22］獲得的極性溶劑化自由能差;GSA為非極性溶劑化自由能差;SA 為溶劑可及表面的表面積，采用Tsui和Case等建立的參數(shù)，γ和β 分別為0.005 42 kcal/(mol·?)和0.92 kcal/mol［23］，在計(jì)算中，溶劑采用介電常數(shù)為78 的連續(xù)介質(zhì)模型，溶質(zhì)的介電常數(shù)視為1，原子的半徑取PARSE 參數(shù)序列。

PBSA 計(jì)算中截取的是軌跡穩(wěn)定狀態(tài)的200 幀構(gòu)象，由于利用正則模擬的Nmode 模塊計(jì)算熵變非常占內(nèi)存［24］，因此，取穩(wěn)定狀態(tài)的構(gòu)象50 幀，并且切除了距離補(bǔ)體抑制劑2.5 nm 外C、N 兩末端不與配體發(fā)生作用的殘基，在整個(gè)體系沒有斷裂共價(jià)鍵的構(gòu)象下計(jì)算熵變［21］。

1.4 能量分解

本研究中能量分解采用GBSA(Generalized Born/Surface Area)方法［25］來計(jì)算。C3c和Compstatin 各個(gè)殘基相互作用能的計(jì)算公式為

其中:△GVDW和△GELE分別為每個(gè)殘基在真空中的范德華作用能和靜電相互作用能;△GGB為每個(gè)殘基的極性溶劑化能，該項(xiàng)由廣義的波恩模型計(jì)算得到;△GGBsur為非極性溶劑化能，由LCPO 模型計(jì)算得到。將每項(xiàng)能量均分解為殘基的主鏈能量貢獻(xiàn)和側(cè)鏈能量貢獻(xiàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 動(dòng)力學(xué)軌跡

圖3 為C3c 蛋白與抑制劑復(fù)合物的骨架原子(CA、N、C)在整個(gè)模擬過程中相對(duì)于初始結(jié)構(gòu)隨時(shí)間變化的均方根偏差(RMSD)，可以看出在整個(gè)10 ns 模擬過程中，RMSD 漲落較小，波動(dòng)范圍為0 ～2 ?，在前3.5 ns 中，曲線一直在波動(dòng)中上升，之后進(jìn)入穩(wěn)定狀態(tài)，RMSD 于1.6 ? 上下浮動(dòng)，直到模擬結(jié)束時(shí)RMSD 不超過2 ?，說明整個(gè)模擬體系是穩(wěn)定的。因此，在最后0.4 ns 的軌跡中選取200 個(gè)構(gòu)象用于自由能計(jì)算是合理的。

2.2 自由能

表1 中列出了各項(xiàng)能量對(duì)吉布斯自由能的貢獻(xiàn)。根據(jù)自由能的計(jì)算公式，可以得出C3c 與Compstatin 的理論結(jié)合自由能為-8.06 kcal/mol，與試驗(yàn)值-6.72 kcal/mol［26］比較吻合，在形成復(fù)合物時(shí)，分子內(nèi)能總和對(duì)配體結(jié)合的貢獻(xiàn)最大，為-177.24 kcal/mol，真空靜電作用能(-108.74 kcal/mol)和范德華作用能(-68.51 kcal/mol)也都有利于補(bǔ)體抑制劑的結(jié)合。

表1 C3c 與Compstatin 結(jié)合自由能的理論計(jì)算值和試驗(yàn)值(ˉx±s)Tab.1 Binding free energy estimated value and experimental energy value between Compstatin and C3c kcal/mol

與眾多文獻(xiàn)一致［21，27-30］，本研究中靜電作用能總和(△GELE+△GPB)為34.35 kcal/mol，不利于配體的結(jié)合，主要表現(xiàn)在極性溶劑化能△GPB(143.09 kcal/mol)阻礙了復(fù)合物的形成，盡管真空靜電作用能△GELE可以補(bǔ)償大部分極性溶劑化能對(duì)補(bǔ)體抑制劑Compstatin 結(jié)合所產(chǎn)生的不利影響，但對(duì)配體結(jié)合的阻礙仍然存在。

2.3 Compstatin 與C3c 的結(jié)合機(jī)制

由復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)可知，Compstatin 與C3c形成了9 對(duì)氫鍵［26］。以其作為對(duì)照比較，將模擬10 ns 的生產(chǎn)相中受體與配體產(chǎn)生的氫鍵列于表2。從表2可見，大部分氫鍵理論計(jì)算值和結(jié)晶試驗(yàn)值相近，模擬過程中沒有發(fā)現(xiàn)ACE0:O-ASN390:OD1和GLN5:NE2-ASP491:OD 之間形成氫鍵，與結(jié)晶試驗(yàn)略有不同。模擬過程中顯示存在兩對(duì)存留時(shí)間很長的氫鍵，如圖4-A 中，一對(duì)為ALA9 主鏈上的N 與ASP491 側(cè)鏈羧基上的OD1 形成了存活率為95.14%的氫鍵，說明這對(duì)氫鍵對(duì)抑制劑與C3c 蛋白結(jié)合非常重要;另外一對(duì)為 MET457:O與TRP7-NE1，MET457 主鏈上的O 充當(dāng)氫受體，配體TRP7 側(cè)鏈上的NE1 充當(dāng)氫供體，這對(duì)氫鍵在模擬過程中存留時(shí)間約9 ns，也對(duì)穩(wěn)定復(fù)合物的形成作出了有利貢獻(xiàn)。

表2 10 ns 模擬中C3c 與抑制劑之間的氫鍵存活率和距離Tab.2 Occupancy and distance of hydrogen bonds between C3c and Compstatin during 10 ns of MD simulation

為了研究C3c 蛋白與Compstatin 結(jié)合的作用機(jī)制，本研究中使用Amber 11 軟件中的GBSA 模塊計(jì)算了抑制劑Compstatin 與C3c 上各殘基的相互作用，其主要作用殘基的能量分解見表3。從表3可見，C3c 上的殘基ARG459、ASP491和MET457 與抑制劑Compstatin 上的殘基TRP7、TRP4、HIS10對(duì)結(jié)合自由能的貢獻(xiàn)較大。其中受體上每個(gè)殘基對(duì)結(jié)合能的貢獻(xiàn)比配體上的殘基貢獻(xiàn)要相對(duì)小一些。在受體上，雖然ASP491 具有最大的靜電能(-22.19 kcal/mol)，但由于側(cè)鏈上較大的極性溶劑化能(23.17 kcal/mol)與其抵消，使ASP491的貢獻(xiàn)(-2.79 kcal/mol)在受體殘基貢獻(xiàn)中排列第二。受體上結(jié)合自由能貢獻(xiàn)最大的是ARG459(-5.14 kcal/mol)，同樣發(fā)現(xiàn)其側(cè)鏈上有巨大的極性溶劑化能(15.36 kcal/mol)與其靜電能(-16.81 kcal/mol)抵消。而在配體中，殘基TRP7的貢獻(xiàn)力最大(-10.741 kcal/mol)，主要來自其側(cè)鏈上的范德華作用能(-8.80 kcal/mol)。正如在平均結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)的，整個(gè)TRP7 的側(cè)鏈像一把鑰匙一樣陷在由LEU492、LEU454、ASP491、GLY489、ARG456、MET457、ARG459 組成的空腔中(圖4-B)，另外，配體中TRP7和TRP4 的重要貢獻(xiàn)與最近的試驗(yàn)結(jié)果吻合［31］。能量分解很好地驗(yàn)證了C3c和抑制劑Compstatin 的結(jié)合模式。這些結(jié)果為基于C3c 蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行合理設(shè)計(jì)補(bǔ)體抑制劑提供了線索。

圖1 抑制劑分子Compstatin 的初始結(jié)構(gòu)Fig.1 The initial conformation of Compstatin

圖2 分子動(dòng)力學(xué)初始結(jié)構(gòu)Fig.2 The initial conformation in molecular dynamics

圖3 C3c 蛋白與抑制劑復(fù)合物的骨架原子(CA、N、C)的RMSD 隨時(shí)間的變化Fig.3 Changes in RMSD of the back bone(CA，N，C)in the C3c-compstatin complex with time

圖4 C3c 蛋白與抑制劑結(jié)合位點(diǎn)Fig.4 The binding site of C3c-compstatin

3 結(jié)論

本研究中采用了MM-PBSA 結(jié)合自由能計(jì)算和GBSA 能量分解的方法，經(jīng)過10 ns的分子動(dòng)力學(xué)取樣，計(jì)算了C3c 蛋白和Compstatin 復(fù)合物的結(jié)合作用能，計(jì)算的結(jié)合能結(jié)果與試驗(yàn)值吻合度較好，并且推斷出對(duì)結(jié)合起關(guān)鍵作用的氨基酸殘基。本研究表明，范德華作用能和非極性溶劑化能對(duì)復(fù)合物結(jié)合起主導(dǎo)作用，如真空靜電作用能(-108.74 kcal/mol)和范德華作用能(-68.51 kcal/mol)為補(bǔ)體抑制劑結(jié)合提供主要貢獻(xiàn)。研究中還發(fā)現(xiàn):受體上ASP491 參與形成的氫鍵時(shí)間最長(9.5 ns)，能量分解中其靜電能貢獻(xiàn)也最大(-22.19 kcal/mol);配體上TRP7 參與形成的氫鍵時(shí)間最長(8.9 ns)，能量分解中其結(jié)合能貢獻(xiàn)也最大(-10.74 kcal/mol)。從能量分解中可以看出，TRP7 側(cè)鏈的范德華作用力為-8.80 kcal/mol，再次說明范德華能對(duì)結(jié)合非常有利，而從平均結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)的TRP 吲哚基團(tuán)恰好插入在結(jié)合位點(diǎn)所形成的空腔中，也為能量計(jì)算進(jìn)行了輔證。通過氫鍵分析和能量分解進(jìn)一步推斷出影響受體和配體結(jié)合的重要氨基酸TRP7、TRP4 及氫鍵ASP491:OD1-ALA9:N和MET457:O-TRP7-NE1，這一結(jié)果填補(bǔ)了X-ray 結(jié)晶試驗(yàn)所得不到的分子動(dòng)態(tài)結(jié)合的信息，為設(shè)計(jì)高效的人類補(bǔ)體C3c 蛋白抑制劑提供了重要的結(jié)構(gòu)信息。

表3 用GB 方法進(jìn)行能量分解的主要貢獻(xiàn)殘基各部分的能量值Tab.3 Energy contribution of the key residues computed by GB model kcal/mol

致謝:感謝大連理工大學(xué)李艷教授提供Amber軟件!

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