劉 敏，彭臻菲，方哲翔，張其清,*，許小平

(1.福州大學生物和醫(yī)藥技術研究院，福建 福州 350002；2.福州大學化學化工學院，福建 福州 350002)

心腦血管疾病是中老年人的常見病和多發(fā)病，動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是心腦血管疾病的主要病理基礎。研究表明早期AS的形成是以血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)異常增殖并遷移至內膜下吞噬脂質作為病變基礎[1]，因此抑制VSMC過度增殖對防治AS具有重要意義。

海帶在我國有悠久的食用歷史，是天然的保健食品，具有提高免疫力、預防心腦血管疾病等功效[2-3]。近些年來研究表明，海帶的藥用價值與其多糖成分密切相關[4]。海帶中提取的多糖具有抗氧化、抗凝血、降血脂等多種生物活性[5-8]，但目前對其抗AS的機制探討較少。本實驗通過堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)誘導建立VSMC增殖模型，研究海帶多糖硫酸酯對VSMC增殖的影響，并初步探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海帶，購自福建省福州市場，經(jīng)鑒定為Laminaria japonica；DMEM培養(yǎng)基 美國Gibco公司；胎牛血清(FBS) 生工生物工程(上海)有限公司；四甲基偶氮唑鹽(MTT) 美國Biosharp公司；堿性成纖維細胞生長因子(bFGF) 加拿大Bio Basic 公司；兔抗α-Actin多克隆抗體北京博奧森生物技術有限公司；超敏即用型二步法檢測試劑盒 北京中杉金橋生物技術有限公司；黃嘌呤氧化酶(Xanthine oxidase) 瑞士Roche公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 海帶多糖硫酸酯的制備

[5,9-11]的方法，制備海帶多糖硫酸酯。具體步驟為：粉碎海帶后取干粉80g，加入1.6L無水乙醇脫脂，60℃水浴3h，不斷攪拌；過濾，烘干濾渣，稱取60g，加入3L蒸餾水，沸水浴提取2次，每次3h；合并提取液，用旋轉蒸發(fā)儀濃縮至2L；緩慢加入500mL無水乙醇和5g CaCl2，靜置12h除去褐藻酸；過濾，加入無水乙醇，使其終體積分數(shù)為75%，靜置6h；過濾，沉淀用蒸餾水溶解，真空冷凍干燥，即得海帶多糖硫酸酯WPS。WPS過DEAE A-25凝膠柱，依次用含0.6、1、2mol/L NaCl的pH7.4的Tris-HCl緩沖液洗脫，部分收集器收集洗脫液，苯酚-硫酸法[12]檢測各管多糖含量。以吸光度為縱坐標，管數(shù)為橫坐標，得到多糖洗脫曲線。依照洗脫曲線分別合并多糖濃度較高的洗脫部分，得到WPS-1、WPS-2和WPS-3共3個多糖硫酸酯組分。多糖各組分經(jīng)酸水解后，依據(jù)明膠-氯化鋇法[13]測定其硫酸根含量。

1.3 抑制VSMC增殖實驗

1.3.1 VSMC培養(yǎng)

取120～180g 雄性SD大鼠胸主動脈，置于盛有無菌DMEM的平皿中，刮除內膜面，剝取中膜層轉移到盛有胎牛血清的平皿中，剪切成1mm3左右的組織塊，貼至培養(yǎng)瓶底部，間距不超過0.5cm，加入3～4mL含有20%胎牛血清的培養(yǎng)液，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。5d后可見細胞從組織塊周圍爬出，待細胞鋪滿底部即用0.25%的胰酶消化傳代。3代后進行細胞鑒定，實驗時使用4～8代細胞。

1.3.2 VSMC鑒定

VSMC固定后，用山羊血清封閉，再加入稀釋的兔抗α-Actin多克隆抗體，4℃孵育過夜后用0.01mol/L PBS清洗，按北京中杉金橋技術有限公司超敏即用型二步法檢測試劑盒說明書進行操作，DAB顯色。對照組用0.01mol/L PBS代替兔抗α-Actin多克隆抗體。

1.3.3 MTT法檢測海帶多糖硫酸酯抑制bFGF誘導的VSMC增殖

參照文獻[14]的方法，將細胞配成2.5×105個/mL細胞懸液，加入96孔板中(0.2mL/孔)，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24h，饑餓處理過夜。加入不同濃度海帶多糖硫酸酯(100μL/孔)作用24h后，加入bFGF繼續(xù)培養(yǎng)。48h后將孔中培養(yǎng)液吸出，加入MTT(100μg/孔)，每組設置6個復孔，578nm波長處檢測OD值。

各組依次加入75mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.8)1mL、樣品0.2mL(對照組用蒸餾水代替)、0.1mol/L鹽酸羥胺溶液0.1mL、75mmol/L黃嘌呤溶液0.1mL和0.037U/mL黃嘌呤氧化酶溶液0.1mL，混勻后37℃孵育30min。再加入2mL顯色劑(0.4g/L甲萘胺+4g/L對氨基苯磺酸)，混勻后靜置5min，波長530nm處測吸光度。

1.5 統(tǒng)計學分析

本實驗中所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學分析，用±s表示，并對結果進行LSD-t檢驗。

2 結果與分析

2.1 VSMC培養(yǎng)

圖1 原代主動脈血管平滑肌細胞(×100)Fig.1 Primary culture of vascular smooth muscle cells (×100)

由圖1可見，培養(yǎng)5d后可見細胞從組織塊周圍爬出(A)，且呈梭狀貼壁生長。培養(yǎng)至12d時可見細胞呈束狀向外延伸生長(B)，至21d呈現(xiàn)“峰-谷”狀生長形態(tài)(C)。

2.2 VSMC鑒定

由圖2可見，免疫組化法鑒定平滑肌α-Actin，倒置顯微鏡下可見胞漿內棕黃色絲狀α肌動蛋白，證實為VSMC。

圖2 免疫組化法鑒定VSMC(×250)Fig.2 Identification of VSMCs by immunohistochemistry (×250)

2.3 海帶多糖硫酸酯對VSMC增殖作用的影響

圖3 WPS、WPS-1、WPS-2和WPS-3對bFGF誘導的VSMC增殖的影響Fig.3 Effects of WPS, WPS-1, WPS-2 and WPS-3 on bFGF-induced proliferation of VSMC

通過MTT法測定OD值可反映細胞生長及增殖活性。在一定細胞數(shù)范圍內，MTT結晶物形成的量與活細胞數(shù)成正比，即OD578nm越高增殖活性越強。本實驗對不同海帶多糖硫酸酯組分對bFGF誘導的VSMC增殖的影響進行研究。由圖3可知，加入bFGF誘導后，模型組VSMC增殖極顯著(P≤0.01)，說明bFGF增殖模型成功建立。在海帶多糖硫酸酯干預下bFGF誘導的VSMC增殖受到抑制，其中WPS對VSMC的增殖抑制作用最為顯著。當WPS質量濃度為0.1mg/mL時測得細胞OD578nm下降至0.244，比模型組降低了0.026。質量濃度達到1mg/mL時，WPS對VSMC的增殖達到最大抑制作用，此時細胞OD578nm已降至0.185，抑制率為31.5%。WPS-1和WPS-3對VSMC的增殖均表現(xiàn)出一定的抑制作用，表現(xiàn)在各多糖干預組VSMC的OD值均比模型組低，尤其在高質量濃度(1mg/mL)條件下抑制作用更為明顯，抑制率均在20%左右。與之相比，WPS-2對VSMC的抑制作用則不顯著，在0.1～1mg/mL質量濃度條件下，抑制率均在10%以內。

表1 1 mg/mL時各樣品組分對·清除力Table 1 Superoxide anion radical scavenging activity of each sample at the concentration of 1 mg/mL

表1 1 mg/mL時各樣品組分對·清除力Table 1 Superoxide anion radical scavenging activity of each sample at the concentration of 1 mg/mL

樣品 WPS WPS-1 WPS-2 WPS-3清除率/% 75.68± 0.45 73.04± 0.65 34.05± 3.08 90.16± 0.93

3 討 論

本實驗從大鼠胸主動脈中取得VSMC，并通過bFGF誘導建立VSMC增殖模型，用于觀察海帶多糖硫酸酯對VSMC異常增殖的抑制作用。實驗結果表明，不同組分海帶多糖硫酸酯對VSMC的增殖抑制活性各不相同。其中，WPS對VSMC的增殖抑制作用最強，WPS-1和WPS-3次之，而WPS-2對VSMC的增殖基本無影響。進一步研究發(fā)現(xiàn)海帶多糖硫酸酯對·清除效應與其抑制VSMC增殖作用基本一致，表現(xiàn)為WPS、WPS-1和WPS-3具有顯著的·清除力，而WPS-2對·清除力較弱。已有研究報道，bFGF刺激VSMC增殖的機制與增加細胞內活性氧濃度有關，胞內H2O2濃度的增加會激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)，從而促使VSMC 增殖[16]。對抗氧化劑Probucol抑制VSMC增殖的研究也表明，Probucol能增強超氧化物歧化酶的活性，降低細胞內活性氧的濃度，從而抑制MAPK信號通路對VSMC增殖的調控[17-18]。由此推測，海帶多糖硫酸酯對VSMC異常增殖的抑制機制與其抗氧化活性密切相關，很可能通過調節(jié)細胞內活性氧水平，維持細胞內的氧化還原平衡狀態(tài)，進而改變對氧化還原敏感的增殖性和抑制性信號蛋白酶和轉錄因子活性之間的平衡，抑制了VSMC增殖。下一步，我們將繼續(xù)探討海帶多糖硫酸酯抑制VSMC增殖機制，為海帶多糖在早期AS防治中的應用提供一定的理論基礎。

參考文獻：

[1]ROSS R.The pathogenesis of atherosclerosisan: an update[J].The New England Journal of Medicine, 1986, 314: 488-500.

[2]王文亮, 王守經(jīng), 宋康, 等.海帶的功能及其開發(fā)利用研究[J].中國食物與營養(yǎng), 2008(8): 26-27.

[3]葉盛英, 李宏.海帶藥用研究進展[J].天津藥學, 2003, 15(6): 58-61.

[4]張洪建, 楊琳, 李勁平.海帶多糖藥理作用研究進展[J].現(xiàn)代藥物與臨床, 2009, 24(4): 217-219.

[5]ZHAO Xue, XUE Changhu, LI Bafang.Study of antioxidant activities of sulfated polysaccharides fromLaminaria japonica[J].J Appl Phycol, 2008, 20: 431-436.

[6]李哲, 羅靜海, 杜曉俊, 等.海帶褐藻多糖提取方法改進及抗凝血探究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學, 2010(4): 297-298.

[7]王庭欣, 王庭祥, 龐佳宏.海帶多糖降血糖、血脂作用的研究[J].營養(yǎng)學報, 2007, 29(1): 99-100.

[8]廖建民, 沈子龍, 張瑾.海帶多糖中不同組分降血脂及抗腫瘤作用的研究[J].中國藥科大學學報, 2002, 33(1): 55-57.

[9]郭亞貞, 王慥.海帶中褐藻糖膠的提取與純化[J].上海水產(chǎn)大學學報, 2000, 9(3): 276-279.

[10]門曉媛, 王一飛, 康琰琰, 等.裙帶菜硫酸多糖的制備及其性質研究[J].食品科學, 2006, 27(3): 156-161.

[11]劉海光.海帶多糖的分離純化及活性研究[D].濟南: 山東大學,2007.

[12]DUBOIS M, GILLIS K A, HAMILTON J K, et al.Colorimetric method for determination of sugarsand related substances[J].Anal Chem, 1956, 28: 350-356.

[13]張惟杰.復合多糖生化研究技術[M].上海: 上?？茖W技術出版社,1987: 296-297.

[14]OKA M, MAEDA S, KOGA N, et al.A modified colorimetric MTT assay adapted for primary cultured hepatocytes: application to proliferation and cytotoxicity assays[J].Biosci Biotech Biochem,1982, 56: 1472-1473.

[15]MITSUHIRO Y.Oxidant stress and atherosclerosis[J].Current Opinion in Pharmacology, 2004, 4: 110-115.

[16]季寧東.血管平滑肌細胞的增殖機制[J].中國基層醫(yī)藥, 2002, 9(3):270-271.

[17]MANTHA SV, KALRA J, PMSAD K.Effects of probucol on hyperebelestexolemia-induced changes in antioxidant enzymes[J].Life Sci, 1996, 58(6): 503-509.

[18]盛林, 潘其興, 劉亞軍, 等.Probucol對堿性成纖維細胞生長因子和過氧化氫促大鼠血管平滑肌細胞增殖的影響[J].中國病理生理雜志, 2001, 17(6): 515-518.