余 濤，李大剛，鄧 寧，向軍儉，宋其芳，賈彥瓊，王 宏,*

(1.暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣東 廣州 510632；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所，廣東 廣州 510640)

玉米赤霉烯酮是由禾谷鐮刀菌和黃色鐮刀菌等真菌產(chǎn)生的有毒次級(jí)代謝產(chǎn)物，廣泛存在于大量谷物，如玉米、大麥、燕麥、小麥、水稻和高粱等[1]。盡管ZEN的毒性較低，但是對(duì)哺乳動(dòng)物的影響超過雌性激素，研究表明[2]ZEN及其代謝物可以引起豬、牛、家禽的雌激素過多癥，以及生殖系統(tǒng)紊亂等癥狀。此外ZEN具有細(xì)胞毒性，并且在體內(nèi)外表現(xiàn)出潛在的遺傳毒性[3]，同樣對(duì)人類也會(huì)產(chǎn)生諸如此類的毒害。因此歐盟及許多國(guó)家制定了谷物及飼料中ZEN最大限量標(biāo)準(zhǔn)[4-5]。

目前用于分析谷類糧食、飼料及食品中ZEN含量的方法主要有薄層色譜(TLC)[6]、高效液相色譜(HPLC)[7]、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)[8-9]等。ELISA法已被AOAC批準(zhǔn)為玉米、小麥、飼料中ZEN的快速篩選方法[10]。免疫學(xué)測(cè)定法特點(diǎn)是特異性強(qiáng)、靈敏度高，并且可以現(xiàn)場(chǎng)篩選大量樣品。然而由于ZEN免疫學(xué)測(cè)定法涉及到使用毒素標(biāo)準(zhǔn)品，包括游離物和偶聯(lián)物，可能對(duì)研制者和使用者帶來毒害。近來，許多科研機(jī)構(gòu)都在研制半抗原的替代品，如利用噬菌體庫篩選多肽模擬ZEN[11]；應(yīng)用抗獨(dú)特型抗體(antiidiotype antibody，Aid)模擬皮質(zhì)醇等[12-13]?？躬?dú)特型抗體是針對(duì)抗體獨(dú)特型產(chǎn)生的抗體[14]，根據(jù)獨(dú)特型的不同，分為幾種類型，其中能夠結(jié)合抗原抗體結(jié)合部位的Aid稱之為Ab2 β，Jerne 稱之為抗原的“內(nèi)影像”，可以模擬抗原的三維結(jié)構(gòu)。本研究是在已制備抗ZEN單抗(Ab1)的基礎(chǔ)上，用IgG-KLH偶聯(lián)物免疫BALB/c小鼠，制備抗ZEN單抗獨(dú)特型抗體(多抗)，并研究抗獨(dú)特型抗體與ZEN之間的“內(nèi)影像”關(guān)系，為抗ZEN單抗獨(dú)特型抗體替代ZEN標(biāo)準(zhǔn)品用于ELISA檢測(cè)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

ZEN毒素標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的鏈霉親和素、HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG(Fc特異性)二抗 美國(guó)Sigma公司；HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG(Fab特異性)二抗 美國(guó)Santa公司；固定化胃蛋白酶、生物素標(biāo)記試劑盒、匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)、BCATMprotein試劑盒 美國(guó)Thermo公司；細(xì)胞培養(yǎng)基RPMI-1640、小牛血清 Gibico公司；Protein G親和層析柱 美國(guó)GE公司；Quickadjuvant佐劑 北京優(yōu)尼康生物科技有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 動(dòng)物及細(xì)胞系

3只BALB/c小鼠(6～8 周齡，雌性) 南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；抗ZEN單抗1G4雜交瘤細(xì)胞株、IgG2b亞類 本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 儀器與設(shè)備

Multiskan MK3 酶標(biāo)儀、細(xì)胞培養(yǎng)箱 美國(guó)Thermo公司；Eppendorf centrifuge 5417R離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf 公司；PowerPac HCTM 電泳儀 美國(guó)Bio-Rad公司；TS-2 型脫色搖床 海門市麒麟醫(yī)用儀器廠；超凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備廠；倒置顯微鏡 日本Olympus公司。

1.4 方法

1.4.1 抗ZEN單抗腹水制備及抗體純化

復(fù)蘇凍存的抗ZEN單抗的雜交瘤細(xì)胞并擴(kuò)大培養(yǎng)，每只BALB/c小鼠提前注射0.5mL弗氏不完全佐劑，1周后每只小鼠腹腔內(nèi)接種1×106個(gè)雜交瘤細(xì)胞，7～10d后抽取腹水。先采用飽和硫酸銨法粗純腹水，再用Protein G親和層析柱進(jìn)行純化，SDS-PAGE鑒定單抗純化效果。

1.4.2 抗ZEN單抗Fab片段制備及鑒定

不同類或亞類抗體的片段化需要選擇不同的蛋白酶，對(duì)于IgG2b亞類的抗體需要用固定化胃蛋白酶進(jìn)行酶切，此亞類抗體對(duì)胃蛋白酶非常敏感，而且酶切產(chǎn)物為Fab/c[15]。首先摸索最佳酶切時(shí)間，分別設(shè)定酶切時(shí)間為1、2、3、4h，37℃條件下進(jìn)行酶切，具體步驟參考Pierce固定化胃蛋白酶說明書。選擇最佳酶切時(shí)間后進(jìn)行大量的酶切IgG抗體(1～10mg)，酶切產(chǎn)物經(jīng)Protein G親和層析柱純化并濃縮后，分裝保存于－20℃，同時(shí)采用凝膠電泳和ELISA法對(duì)單抗Fab片段活性進(jìn)行鑒定。

1.4.3 免疫原抗ZEN單抗-血藍(lán)蛋白(KLH)偶聯(lián)物的制備

抗ZEN單抗為鼠源性抗體，如果用單抗直接免疫BALB/c小鼠，免疫原性很弱，需要將抗ZEN單抗進(jìn)行修飾。參考Toshifumi等[13]，通過化學(xué)偶聯(lián)劑EDC IgG與KLH偶聯(lián)，將25.6mg EDC加入4mg/mL IgG溶液(PBS，500μL)中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)30min，然后加入2mg/mL的KLH溶液(PBS，1mL)，4℃反應(yīng)過夜，反應(yīng)產(chǎn)物用PBS透析2d，即獲得免疫原 IgG-KLH偶，分裝并保存于－20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4.4 動(dòng)物免疫

使用Quickadjuvant高效免乳化佐劑進(jìn)行免疫，此佐劑的特點(diǎn)是免疫劑量少、免疫周期短，并且可以保持免疫原活性。以免疫原IgG-KLH偶聯(lián)物免疫3只BALB/c小鼠，免疫劑量為每只小鼠50μg，等體積免疫原與佐劑(各50μL)快速混勻后，小腿肌肉注射，免疫周期為3周，共免疫3次。

1.4.5 血清分離及純化

第3次免疫后2周，摘眼球取血，37℃放置1h，然后4℃過夜，3000r/min離心10min，收集上清即為血清。采用辛酸-硫酸銨進(jìn)行純化，BCA試劑盒測(cè)定純化抗體質(zhì)量濃度。

1.4.6 抗ZEN單抗生物素標(biāo)記

由于本研究中制備的抗獨(dú)特型抗體為鼠源性多抗，為了方便研究抗獨(dú)特型抗體與ZEN之間內(nèi)影像關(guān)系，需要將抗ZEN單抗進(jìn)行生物素標(biāo)記，建立生物素-鏈霉親和素檢測(cè)系統(tǒng)。標(biāo)記過程參考Pierce 生物素標(biāo)記試劑盒說明書，將3.5mg Ab1溶入1mL 0.01mol/L PBS(pH7.2)中，然后加入51μL 20mmol/L NHS-LC-Biotin溶液，室溫反應(yīng)1h，用Zeba脫鹽離心柱對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行脫鹽，即獲得Biotin-ZEN單抗。

1.4.7 抗ZEN單抗獨(dú)特型抗體鑒定

采用間接ELISA測(cè)定抗獨(dú)特型抗體效價(jià)，將檢測(cè)原Fab用包被緩沖液稀釋至0.5μg/mL，加入96孔酶標(biāo)板，每孔100μL，37℃孵育3h；300μL磷酸鹽-吐溫溶液(PBST)洗板3次；加入200μL 5%脫脂乳粉，37℃封閉1h；300μL PBST洗板3次；加入100μL倍比稀釋的抗血清，37℃孵育1h；300μL PBST洗板3次；加入100μL 1∶10000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG(Fc特異性)二抗，37℃孵育40min；300μL PBST洗板5次；加入100μL TMB底物，避光顯色10min；加入50μL 2mol/L硫酸終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀測(cè)定OD450nm值，當(dāng)其在1.0左右時(shí)，抗血清稀釋倍數(shù)就是其效價(jià)。

間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定抗獨(dú)特型抗體靈敏度，操作過程類似于間接ELISA，不同處為同時(shí)加入50μL不同濃度的ZEN競(jìng)爭(zhēng)物和50μL 2倍于抗獨(dú)特型抗體效價(jià)的抗血清。

1.4.8 替代標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

間接ELISA測(cè)定Biotin-ZEN單抗的效價(jià)，包被緩沖液將檢測(cè)原ZEN-BSA稀釋至0.5μg/mL，加入96孔酶標(biāo)板，每孔100μL，37℃孵育3h；300μL PBST洗板3次；加入200μL 5%脫脂乳粉，37℃封閉1h；300μL PBST洗板3次；加入倍比稀釋的Biotin-ZEN單抗，每孔100μL，37℃孵育1h；300μL PBST洗板3次；加入100μL 1∶800稀釋的HRP標(biāo)記的鏈霉親和素，37℃孵育40min；300μL PBST洗板5次；加入100μL TMB底物，避光顯色10min；加入50μL 2mol/L硫酸終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀測(cè)定OD450nm值，OD450nm值在1.0左右時(shí)的抗體稀釋倍數(shù)為Biotin-ZEN單抗的效價(jià)。

采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA研究ZEN與替代物抗獨(dú)特型抗體之間的相關(guān)性，首先建立ZEN毒素或抗獨(dú)特型抗體競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線，過程如上所述，不同之處為同時(shí)加入50μL系列質(zhì)量濃度(0.5～160ng/mL)的ZEN標(biāo)準(zhǔn)品或系列質(zhì)量濃度(0.098～6.250μg/mL)的抗獨(dú)特型抗體和50μL 2倍于效價(jià)的Biotin-ZEN單抗。根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)繪制在相同抑制率條件下，ZEN質(zhì)量濃度(μg/mL)與抗獨(dú)特型抗體質(zhì)量濃度(ng/mL)間的相關(guān)性曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗ZEN單抗純化效果鑒定

圖1 腹水及純化腹水的SDS-PAGE圖Fig.1 SDS-PAGE of ascites and purified ascites

采用12%分離膠的SDS-PAGE鑒定抗ZEN單抗純度，結(jié)果如圖1所示，純化后的單抗只有2條帶，分別是50kD處的重鏈和25kD的輕鏈，表明抗體純度很高。

2.2 抗ZEN單抗Fab片段特性鑒定

圖2 非變性PAGE研究酶切時(shí)間對(duì)IgG片段化的影響(a)和非還原SDS-PAGE鑒定Fab抗體片段(b)Fig.2 Effect of digestion time on pepsin digestion of IgG assessed by native-PAGE and the identification of Fab fragment by non-reduced SDS-PAGE

抗ZEN單抗酶切產(chǎn)物進(jìn)行非變性凝膠電泳，結(jié)果如圖2a所示，酶切1h獲得的片段化抗體最多，隨著酶切時(shí)間的增加，片段化抗體逐漸減少，因此選擇酶切時(shí)間為1h。酶切產(chǎn)物經(jīng)Protein G層析柱純化，非還原性SDSPAGE鑒定純化后產(chǎn)物，圖2b顯示酶切片段分子質(zhì)量為50kD，與抗體片段Fab大小吻合。

采用間接ELISA和間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA鑒定Fab片段活性，結(jié)果如表1所示，F(xiàn)ab片段的比效價(jià)比抗ZEN單抗低，但靈敏度較完整抗體提高了3倍，表明制備的Fab片段活性較好，可以作為檢測(cè)原，用于檢測(cè)抗ZEN單抗獨(dú)特型抗體。

表1 抗ZEN單抗與抗體片段Fab特性對(duì)比Table 1 Characteristic comparison of anti-ZEN monoclonal antibody and Fab fragment

2.3 抗ZEN單抗獨(dú)特型抗體特性鑒定

表2 間接ELISA測(cè)定抗血清效價(jià)Table 2 Indirect ELISA determination of antiserum titer

間接ELISA測(cè)定三免后抗血清效價(jià)，從表2可知，1、2、3號(hào)鼠的抗血清效價(jià)分別為1∶3200、1∶1600、1∶400。同時(shí)采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定3只小鼠抗血清靈敏度(圖3)，其中1號(hào)鼠的靈敏度最高，競(jìng)爭(zhēng)物ZEN的IC50值為33.8ng/mL，檢出限(IC10)為0.06ng/mL，因此選擇純化1號(hào)鼠抗血清，共獲得0.3mL純化抗體，BCA試劑盒測(cè)得純化抗體的質(zhì)量濃度為10mg/mL。

圖3 間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)抗血清對(duì)ZEN的抑制曲線Fig.3 Inhibitory curve of antiserum against ZEN determined by indirect competitive ELISA

2.4 抗ZEN單抗獨(dú)特型抗體與ZEN間“內(nèi)影像”關(guān)系

首先間接ELISA測(cè)定Biotin- ZEN單抗的工作濃度為1∶40000，以Biotin- ZEN單抗為反應(yīng)抗體，分別以不同質(zhì)量濃度的ZEN毒素或抗ZEN單抗獨(dú)特型抗體為競(jìng)爭(zhēng)物，建立競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線。由圖4可知，抗獨(dú)特型抗體能否替代ZEN實(shí)現(xiàn)無毒檢測(cè)，必須分析抗ZEN單抗獨(dú)特型抗體與ZEN之間的相關(guān)度，根據(jù)抑制率在20%～80%間，在相同抑制率條件下，ZEN質(zhì)量濃度與抗獨(dú)特型抗體間濃度對(duì)應(yīng)關(guān)系，繪制替代標(biāo)準(zhǔn)曲線及對(duì)應(yīng)的線性回歸方程(圖5)，線性回歸方程為y=37.22x－13.144(R2=0.99)，y為ZEN質(zhì)量濃度(ng/mL)；x為抗獨(dú)特型抗體質(zhì)量濃度(μg/mL)，相關(guān)系數(shù)R2達(dá)到0.99，表明抗ZEN單抗獨(dú)特型抗體與ZEN毒素間相關(guān)度很高，可以稱為ZEN的“內(nèi)影像”，因此可以用抗ZEN單抗獨(dú)特型抗體替代ZEN毒素用于無毒檢測(cè)。

圖4 ZEN(a)及Aid(b)的標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線Fig.4 Standard curves of ZEN and anti-ZEN antibody

圖5 抗ZEN單抗獨(dú)特型抗體與ZEN標(biāo)準(zhǔn)品之間的相關(guān)性Fig.5 Correlation between anti-ZEN antibody and ZEN standard

3 討論與結(jié)論

在目前的免疫技術(shù)中，抗獨(dú)特性抗體的研制是一種可行的免疫原替代技術(shù)，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)報(bào)道了很多關(guān)于抗獨(dú)特性抗體替代小分子半抗原應(yīng)用于檢測(cè)的報(bào)道，如背景中提到的制備皮質(zhì)醇的抗獨(dú)特型抗體并建立非競(jìng)爭(zhēng)ELISA，國(guó)內(nèi)的制備T-2毒素、大田海綿酸、黃曲霉毒素等抗獨(dú)特型抗體，用于建立無毒檢測(cè)方法[16-18]。

在制備抗獨(dú)特型抗體過程中，受到很多因素的影響，尤其是制備Ab2 β，例如免疫動(dòng)物的選擇，免疫原的修飾，佐劑的選擇等[19]。本研究選擇免疫的是小鼠，這樣理論上產(chǎn)生的抗體應(yīng)該都是抗獨(dú)特型抗體，但因免疫原性很弱，產(chǎn)生能夠結(jié)合抗原抗體結(jié)合部位的抗體很少，需要對(duì)免疫原即抗體進(jìn)行修飾，將單抗與載體蛋白KLH偶聯(lián)，可以極大地增強(qiáng)單抗的免疫原性[20]。此外，利用高效免疫佐劑Quickadjuvant替代常規(guī)使用的弗氏佐劑進(jìn)行免疫，該類佐劑的特點(diǎn)是不破壞抗原天然構(gòu)像，尤其是抗原抗體結(jié)合部位，能夠最大程度的保持免疫原的活性，產(chǎn)生更多的Ab2 β。

本研究經(jīng)過多次免疫，成功研制出抗ZEN單抗獨(dú)特型抗體(鼠多抗)，而且抗獨(dú)特性抗體與毒素ZEN間相關(guān)度很高，R2值達(dá)到0.99，因此可以作為ZEN標(biāo)準(zhǔn)品的替代品應(yīng)用于ELISA檢測(cè)，為實(shí)現(xiàn)ZEN毒素的無毒檢測(cè)方法的建立奠定基礎(chǔ)。

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