李 妍，吳慶紅，陳義倫,*，周 波*

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 泰安 271018；2.泰山學(xué)院附屬中學(xué)，山東 泰安 271018；3.土肥資源高效利用國家工程實驗室，山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 泰安 271018)

血栓病威脅著人類的健康與生命，溶解血栓是治療這類疾病的首選方法；當(dāng)前的溶栓劑，如尿激酶、鏈激酶、重組組織型纖溶酶原激活劑等，存在半衰期短、副作用大、價格昂貴等缺點(diǎn)[1-3]。納豆激酶(nattokinase，NK)是一種在納豆發(fā)酵過程中由納豆菌(Baciuus natto)或納豆枯草桿菌(B.subtilis natto)產(chǎn)生的絲氨酸蛋白酶[4-5]，研究表明[6-8]納豆激酶成本低廉，作用迅速，藥效時間長，安全性好，具有很強(qiáng)的纖溶活性，不但能直接作用于纖溶蛋白，而且還能激活體內(nèi)纖溶酶原，從而增加內(nèi)源性纖溶酶的量與作用，有望稱為新型的溶栓藥物。響應(yīng)面分析法(response surface methodology，RSM)是能通過綜合實驗設(shè)計和數(shù)學(xué)建模得到準(zhǔn)確有效結(jié)論的實驗設(shè)計方法[9-10]，被廣泛應(yīng)用于各類發(fā)酵條件的優(yōu)化[11-15]。

本課題組在前期的研究中篩選到一株納豆芽孢桿菌，采用Plackett-Burman法和響應(yīng)面分析法的方法對該菌產(chǎn)納豆激酶的液體發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，以期獲得較高的納豆激酶產(chǎn)量，對該酶進(jìn)一步的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與培養(yǎng)基

1.1.1 材料與試劑

菌種為山東農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境微生物實驗室保藏的納豆芽孢桿菌。

凍干人纖維蛋白原 上海萊士血制品有限公司；凝血酶 美國Sigma公司；尿激酶 阿拉丁公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10、酵母抽提物5、NaCl 10，pH7.0；種子培養(yǎng)基：純牛乳100mL、葡萄糖2.5g；發(fā)酵培養(yǎng)基：胰蛋白胨、乳糖、Na2HPO4、NaH2PO4、CaCl2、MgSO4，pH7.0。

1.2 方法

1.2.1 粗酶液的制備

納豆芽孢桿菌菌株經(jīng)過斜面培養(yǎng)基活化24h后，轉(zhuǎn)接到種子培養(yǎng)基中，30℃、180r/min培養(yǎng)12h，按一定的接種量接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃、180r/min培養(yǎng)56h后，取發(fā)酵液于4℃、8000r/min冷凍離心10min得到的上清液，即為粗酶液。

1.2.2 酶活力的測定方法

納豆激酶酶活力測定采用纖維蛋白平板法[10]，以尿激酶繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 產(chǎn)酶條件的單因素試驗

在發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上選擇不同的碳源、氮源以及營養(yǎng)鹽之比進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶[16-17]，確定菌株的產(chǎn)酶最優(yōu)培養(yǎng)基組成；并且在產(chǎn)酶最優(yōu)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上進(jìn)行發(fā)酵條件的優(yōu)化，包括種齡、接種量、發(fā)酵時間、培養(yǎng)溫度、裝液量。

1.2.4 Plackett-Burman篩選影響產(chǎn)酶的重要因素設(shè)計

實驗中選用n=12的PB設(shè)計，把每個因素設(shè)計成高(+1)和低(－1)2個水平。

1.2.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

采用響應(yīng)面分析法中的Box-Behnken試驗設(shè)計[18-20]，對PB實驗篩選到的關(guān)鍵因子做進(jìn)一步的分析，獲得影響該菌發(fā)酵產(chǎn)酶的最優(yōu)發(fā)酵條件。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Design Expert統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 納豆芽孢桿菌產(chǎn)酶條件的優(yōu)化結(jié)果

2.1.1 最適發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化結(jié)果

2.1.1.1 碳源對產(chǎn)酶的影響

采用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(g/L)為：胰蛋白胨20.0、Na2HPO45.0、NaH2PO41.0、CaCl20.2、MgSO40.5，分別以葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、麩皮為碳源，添加量為10g/L，進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶實驗，研究碳源對產(chǎn)酶的影響，結(jié)果見圖1。乳糖作為碳源時，最有利于產(chǎn)酶，其次是葡萄糖；麩皮和麥芽糖作為碳源，產(chǎn)酶量不高，當(dāng)蔗糖作為碳源時，發(fā)酵過程則不產(chǎn)生納豆激酶，這與已往的研究存在差異[16]，可能是因為菌株的差異造成的結(jié)果。

圖1 碳源對產(chǎn)酶的影響Fig.1 Effect of carbon source on the activity of nattokinase

2.1.1.2 氮源對產(chǎn)酶的影響

采用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(g/L)為：乳糖10.0、Na2HPO45.0、NaH2PO41.0、CaCl20.2、MgSO40.5，分別以胰蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、硫酸銨、磷酸二氫銨作為氮源，添加量為20g/L，進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶實驗，研究氮源對產(chǎn)酶的影響，結(jié)果見圖2。最適氮源為牛肉膏，其次是胰蛋白胨和酵母粉，而硫酸銨和磷酸二氫銨作為氮源不能滿足大量產(chǎn)酶的需求，出于實驗操作的考慮，本實驗采用胰蛋白胨作為氮源。

圖2 氮源對產(chǎn)酶的影響Fig.2 Effect of nitrogen source on the activity of nattokinase

2.1.2 最適發(fā)酵條件的優(yōu)化結(jié)果

2.1.2.1 種齡對產(chǎn)酶的影響

圖3 種齡對產(chǎn)酶的影響Fig.3 Effect of inoculation age on the activity of nattokinase

在最適發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，將種齡分別為10、12、14、18、24h的種子活化液接入搖瓶進(jìn)行發(fā)酵實驗，結(jié)果見圖3。最初隨著種齡的增加，細(xì)菌數(shù)量的增多，產(chǎn)酶量逐漸提高，當(dāng)用種齡為12h的活化液進(jìn)行發(fā)酵，最有利于產(chǎn)酶。當(dāng)種齡超過12h后，隨著細(xì)菌生長活力的下降，產(chǎn)酶量開始降低，至24h時活化液非常不利于產(chǎn)酶。

2.1.2.2 接種量對產(chǎn)酶的影響

在最適發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，將種齡為12h的種子活化液按1%、2%、3%、4%、5%、6%的接種量接入搖瓶進(jìn)行發(fā)酵實驗，結(jié)果見圖4。接種量為2%時，最有利于產(chǎn)酶。接種量過高或過低都不利于產(chǎn)酶，過低影響細(xì)菌數(shù)量，導(dǎo)致產(chǎn)酶不足；過高則因為培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分被大量的微生物的生長而快速消耗，影響了發(fā)酵后期的產(chǎn)酶。

圖4 接種量對產(chǎn)酶的影響Fig.4 Effect of inoculum size on the activity of nattokinase

2.1.2.3 發(fā)酵時間對產(chǎn)酶的影響

在最適發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，選定不同發(fā)酵時間12、24、36、48、56、64、72h進(jìn)行酶活力測定，結(jié)果見圖5。隨著發(fā)酵時間的增加，產(chǎn)酶量逐漸提高，當(dāng)發(fā)酵時間超過50h，產(chǎn)酶量趨于穩(wěn)定，因此將56h作為最適發(fā)酵時間。

圖5 發(fā)酵時間對產(chǎn)酶的影響Fig.5 Effect of fermentation time on the activity of nattokinase

2.2 Plackett-Burman設(shè)計篩選影響產(chǎn)酶的重要因素

在單因素試驗的基礎(chǔ)上選取各因素的高、低水平，按表1設(shè)計進(jìn)行了3輪重復(fù)試驗，取樣測定納豆激酶的酶活力，取3次測量的平均值，結(jié)果見表1。計算各因素效應(yīng)，評價其重要性，各因素所代表的參數(shù)、水平見表2。這個模型是顯著的，胰蛋白胨添加量、MgSO4添加量、接種量及發(fā)酵溫度是影響產(chǎn)酶的重要因素，其中胰蛋白胨添加量、MgSO4添加量、接種量呈現(xiàn)顯著的正效應(yīng)，發(fā)酵溫度則呈現(xiàn)負(fù)效應(yīng)，因此應(yīng)當(dāng)提高胰蛋白胨添加量、MgSO4添加量、接種量，降低發(fā)酵溫度。根據(jù)P值大小，選擇3個因素：胰蛋白胨添加量、MgSO4添加量及發(fā)酵溫度進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗。

表1 Plackett-Burman試驗設(shè)計與結(jié)果(n=12)Table 1 Design and results of Plackett-Burman tests (n=12)

表2 Plackett-Burman試驗因素、水平及其效應(yīng)Table 2 Factors, levels and effects of Plackett-Burman tests

2.3 中心組合試驗

表3 中心組合試驗的自變量及其水平Table 3 Variables and levels of central composite tests

表4 中心組合試驗設(shè)計及結(jié)果Table 4 Design and results of central composite tests

利用Box-Behnken進(jìn)行響應(yīng)面試驗設(shè)計，對PB試驗篩選出3個顯著因素進(jìn)行優(yōu)化，以酶活力為響應(yīng)值，對應(yīng)于因變量Y。各自變量水平見表3，試驗設(shè)計及結(jié)果見表4。

通過Design Expert1軟件對試驗結(jié)果進(jìn)行分析，獲得回歸方程如下：

通過對上述二次回歸方程進(jìn)行方差分析，驗證回歸模型及各參數(shù)的顯著度，結(jié)果見表5。

表5 酶活力二次多項模型的方差分析表Table 5 Analysis of variance for quadratic model of nattokinase activity

由表5可見，模型Prob＞F值＜0.0500，該模型是顯著的，確定系數(shù)R2=96.3%，表明該模型與實際情況擬合很好。因此該模型可用于分析和預(yù)測納豆芽孢桿菌液體發(fā)酵產(chǎn)納豆激酶的酶活力。

圖6～8為響應(yīng)面分析的曲面圖，可直觀地看出各變量與響應(yīng)值，變量與變量之間的關(guān)系，而且回歸模型確實存在最大響應(yīng)值。該模型可預(yù)測的最大值為739.818U/mL，此時極值點(diǎn)坐標(biāo)：X1=26.6g/L，X2=1.35g/L，X3=33℃。為了檢驗?zāi)Ｐ皖A(yù)測的準(zhǔn)確性，在優(yōu)化條件下進(jìn)行發(fā)酵驗證實驗，即發(fā)酵培養(yǎng)基條件為：胰蛋白胨26.6g/L、乳糖10.0g/L、Na2HPO45.0g/L、NaH2PO41.0g/L、CaCl20.2g/L、MgSO41.35g/L；發(fā)酵條件為：種齡12h、接種量2%、發(fā)酵溫度33℃、發(fā)酵時間56h、裝液量50mL/250mL時，所得納豆激酶酶活力為743.65U/mL，比優(yōu)化前提高了232.33U/mL，可見該模型能較好的預(yù)測實際產(chǎn)酶情況。

圖6 Y=f(X1, X2)響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface plot for Y = f(X1, X2)

圖7 Y=f(X1, X3)響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface plot for Y = f(X1, X3)

圖8 Y=f(X2, X3)響應(yīng)面圖Fig.8 Response surface plot for Y = f(X2, X3)

3 結(jié) 論

本研究在單因素試驗的基礎(chǔ)上，利用Plackett-Burman法篩選出影響產(chǎn)納豆激酶的重要因素有胰蛋白胨添加量、MgSO4添加量和發(fā)酵溫度；然后采用Box-Behnken實驗設(shè)計對這3個重要因素做進(jìn)一步分析，獲得最優(yōu)的發(fā)酵產(chǎn)酶條件為：發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)條件：胰蛋白胨26.6、乳糖10.0、Na2HPO45.0、NaH2PO41.0、CaCl20.2、MgSO41.35；發(fā)酵條件：種齡12h、接種量2%、發(fā)酵溫度33℃、發(fā)酵時間56h、裝液量50mL/250mL；此時實際產(chǎn)酶活力為743.65U/mL，與回歸模型預(yù)測值存在較小的誤差，驗證了回歸模型的準(zhǔn)確性；在此發(fā)酵條件下，納豆激酶的酶活力較優(yōu)化前提高了232.33U/mL。

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