鄧凱波，霍貴成*

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品科學(xué)教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030)

自古以來，乳酸菌就是人們廣泛使用的一類益生菌?，F(xiàn)代工業(yè)中，益生菌發(fā)酵制品種類繁多，很多乳酸菌被用作發(fā)酵劑應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，其中嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)為應(yīng)用最廣泛的乳酸菌之一。然而，由于噬菌體污染而導(dǎo)致的生產(chǎn)失敗已造成了重大的經(jīng)濟損失。盡管研究者們已采取了許多手段[1]，但收效甚微。

規(guī)律成簇的間隔回文重復(fù)(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)以“重復(fù)序列-間隔區(qū)(repeat-spacer)”為單元組成了原核生物基因組上的一段非編碼區(qū)，是專門針對噬菌體及質(zhì)粒等外源基因的獲得性免疫系統(tǒng)[2-4]。CRISPR序列的典型結(jié)構(gòu)為21～48bp的重復(fù)序列和其間插入的相似長度的非重復(fù)間隔序列組成[2]。目前，嗜熱鏈球菌CRISPR序列結(jié)構(gòu)和作用機理方面的研究僅在Streptococcus thermophilusDGCC 7710中最為詳盡[5-9]，我國尚無相關(guān)報導(dǎo)。探明我國嗜熱鏈球菌中的CRISPR序列結(jié)構(gòu)，對其進化研究以及今后噬菌體抗性突變菌株的構(gòu)建都具有重大意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

8株嗜熱鏈球菌(S.thermophilus)S0、S4、S06、S07、S14、S18、St和SM由KLDS-DICC保藏；E.coliDH5α為實驗室保存。pMD18-T載體、限制性內(nèi)切酶EcoRI、PCR體系中的GC bufferⅠ、LA Taq擴增酶 日本TaKaRa公司；細菌基因組提取試劑盒、膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒 天根生化科技(北京)有限公司。

GM17培養(yǎng)基：蛋白胨5.0g、酵母提取物5.0g、胰蛋白胨5.0g、抗壞血酸0.5g、牛肉浸膏2.5g、β-甘油磷酸二鈉19g、瓊脂15g，1.0mol/L MgSO4·7H2O 1.0mL，蒸餾水定容至1L，118℃滅菌20min。固體GM17培養(yǎng)基另添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%的瓊脂。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g，用蒸餾水定容至1L，調(diào)至pH 7.0，118℃條件下滅菌20min。固體LB培養(yǎng)基另添加1.5%的瓊脂。

氨芐霉素LB培養(yǎng)基(LB-Amp+)：LB培養(yǎng)基配制滅菌后，溫度降至55℃左右，添加終質(zhì)量濃度為100μg/mL的氨芐霉素，搖勻后使用。

1.2 儀器與設(shè)備

580BR 5360型梯度PCR儀 美國伯樂公司；9700 PCR System 美國ABI公司；DYY-10C電泳儀 北京六一儀器廠；UVP凝膠成像系統(tǒng) 美國UVP公司。

1.3 方法

1.3.1 嗜熱鏈球菌CRISPR序列引物設(shè)計

根據(jù)CRISPR database(http∶//crispr.u-psud.fr/crispr/)公布的S.thermophilusLMD-9全序列菌株的3個CRISPR序列信息設(shè)計3對引物分別為：P1(正向引物：5’-GAATCACTATGTGGGTATG-3’，反向引物：5’-TTCAGGTGTTTACGGACT-3’)、P2(正向引物：5’-CTTTAGGGTAATGGCGTGAGGGTG-3’，反向引物：5’-ACTTTCTGGAAGCGGTGGCAATAA-3’)和P3(正向引物：5’-GAGGCTACCTGAATAATCCGACC-3’，反向引物：5’-GGCTCTGTATGAAGTTGAATGGG-3’)，引物設(shè)計采用Primer premier 5軟件。

1.3.2 引物退火溫度確定

采用梯度PCR方法對3對引物的退火溫度進行摸索，采用小劑量擴增體系，分別以S0、St和SM基因組DNA為模板，根據(jù)電泳結(jié)果確定最佳退火溫度。

1.3.3 CRISPR序列擴增

3對引物分別對供試菌株基因組進行CRISPR序列擴增，反應(yīng)緩沖液采用GC bufferⅠ，擴增酶為LA Taq，并采用最佳退火溫度，電泳鑒定結(jié)果。

1.3.4 CRISPR序列片段連接轉(zhuǎn)化和鑒定

回收得到目的片段與pMD18-T載體連接后，轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細胞E.coliDH5α。對陽性菌落進行質(zhì)粒提取，并用限制性內(nèi)切酶EcoRI進行酶切鑒定，對目的片段測序。

1.3.5 CRISPR序列BLAST比對和同源性分析

測序結(jié)果用BLAST CRISPR進行基因同源性比對，得到并構(gòu)建出該菌株的CRISPR序列結(jié)構(gòu)，以及重復(fù)序列(DR)和間隔區(qū)序列(spacer)。并將得到的CRISPR序列與標(biāo)準(zhǔn)菌株CRISPR序列進行多重序列比對。

1.3.6 重復(fù)序列二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

采用CLC sequence viewer 6對供試菌株與標(biāo)準(zhǔn)菌株的DR進行多重比對，并對結(jié)果進行DNA sequence logo(http∶//weblogo.berkeley.edu/logo.cgi)作圖，并采用RNAfold web server (http∶//rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi)預(yù)測序列的二級結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物退火溫度確定

分別用P1、P2和P3對S.thermophilusS14、St和SM基因組進行梯度擴增，對退火溫度梯度設(shè)定，結(jié)果如圖1所示。

圖1 3對引物溫度梯度PCR擴增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Agarose gel pattern of gradient PCR products by three pairs of primers

由圖1可知，3對引物的擴增產(chǎn)物效率均隨著溫度有遞增或遞減變化，確定P1、P2和P3的退火溫度范圍可分別在52.3～62.0℃、50.0～59.6℃和50.0～54.4℃，據(jù)此確定3對引物最佳退火溫度均為52.3℃。

2.2 CRISPR序列的擴增與測序

按照最佳退火溫度，分別用P1、P2和P3對8株供試嗜熱鏈球菌的CRISPR序列進行擴增，產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖2，CRISPR詳細信息見表1。

表1 嗜熱鏈球菌CRISPR信息Table 1 Information of Streptococcus thermophilus CRISPR

圖2 CRISPR序列擴增電泳圖Fig.2 Agarose gel pattern of CRISPR amplification

由圖2和表1可知，在所有供試菌株的CRISPR擴增中，只有S4在以P2和P3為引物的條件下無擴增結(jié)果，說明在此菌株中不存在該兩段序列，其他得到理想的擴增結(jié)果經(jīng)測序和CRISPR Finder分析后，均鑒定為CRISPR序列，存在率達到100%，遠高于CRISPR database公布的在細菌范圍內(nèi)的比例(46.4%，截止至2011年10月)。CRISPR最短僅為101bp，存在1個Spacer(S0和S6)；最長為2853bp，其中包含43個Spacer(S4)。對于8株供試菌株，3對引物對應(yīng)的CRISPR中DR序列相同，大小為30～38bp，但其DR-Spacer單元的數(shù)量并不一致。CRISPR在一定程度上可反應(yīng)出細菌的進化歷程[10]，這種現(xiàn)象也許是由于菌株生長環(huán)境不同造成的序列差異的結(jié)果。

將P1、P2和P3相對應(yīng)的DR序列分別命名為：DR1(5’-GATATAAACCTAATTACCTCGAGAGGGGACGGA AAC-3’)、DR2(5’-GTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGT AACTGTACAAC-3’)和DR3(5’-GTTTTAGAGCTGTGTT GTTTCGAATGGTTCCAAAAC-3’)。

2.3 DR序列同源性比較

分別對這3種DR進行BLAST同源性比對(E值＜0.1)，結(jié)果見表2。DR1～DR3的高同源性(E值＜0.1)的菌株均為乳球菌屬，這與其菌屬親緣關(guān)系具有一定的一致性；其中DR1高同源性菌株僅4株，其中前3株均與供試菌株同種，且同源性為100%；與DR2同源性100%菌株除嗜熱鏈球菌外，有一株為S.gordoniistr.Challissubstr.CH1，另外還有若干S.thermophilusDGCC7710的突變體分離株(*號)；這一現(xiàn)象在DR3中更為明顯，而同為嗜熱鏈球菌的S.thermophilusCNRZ1066和S.thermophilusLMG 18311，其同源性卻相對較低。這種同種不同源，同源卻不同種的現(xiàn)象已在多種細菌的CRISPRs序列中發(fā)現(xiàn)[11-15]，研究者們將這種現(xiàn)象稱為水平基因轉(zhuǎn)移(HGT)，與基因轉(zhuǎn)座類似，這種機制也許能增強菌株的環(huán)境適應(yīng)力和功能基因的傳播。

表2 CRISPRDR同源性比對結(jié)果Table 2 Homology alignment of CRISPR DR

2.4 重復(fù)序列二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

重復(fù)序列比對和二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果如圖3～5所示。其中二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測均采用中心二級結(jié)構(gòu)法(centroid secondary structures)，并記錄形成結(jié)構(gòu)的最小自由能(kcal/mol)。

圖3 DR1高同源性序列多重比對及二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.3 Multiple alignment and second structure prediction of DR1 with high homology

圖4 DR2高同源性序列多重比對及二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.4 Multiple alignment and second structure prediction of DR2 with high homology

圖5 DR3高同源性序列多重比對及二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.5 Multiple alignment and second structure prediction of DR3 with high homology

由圖3～5可知，DR1～DR3的高同源群一致序列均為36bp，可形成類似發(fā)夾環(huán)的二級結(jié)構(gòu)。其中，DR1(圖3c)環(huán)頭部僅為6堿基組成，莖區(qū)長4堿基；而2DR(圖4c)頭部為21堿基形成的大環(huán)，莖區(qū)為6堿基。對于頭部大小對DR功能的影響尚無報道。尾部差異也比較大，其中，DR1(圖3c)尾部長達16和8堿基，DR2(圖4c)適中，為4和1堿基，而DR3(圖5c)除頭部外，按照最小自由能原則，均形成了莖區(qū)，尾部沒有游離堿基。各圖b中，重復(fù)結(jié)構(gòu)一致序列的堿基互補配對，對其進行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測可知，均形成了發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)(圖3c、4c、5c)。3個高同源群二級結(jié)構(gòu)的最小自由能分別為：DR1群：－7.10kcal/mol；DR2群：－3.71kcal/mol；DR3群：－4.60kcal/mol。

據(jù)推測，回文結(jié)構(gòu)可能與新Spacer的效率有關(guān)。新增間隔區(qū)通常會插入CRISPR前導(dǎo)序列與第一個DR之間[5,16]。在內(nèi)切酶將切口打開后，較大的游離尾巴顯然會對Spacer的插入比較有利。這一推測很可能影響到CRISPR對外源染色體的抵抗作用。

3 結(jié) 論

8株供試嗜熱鏈球菌均檢測出CRISPR序列，其中S4具有1條，其余7株均含有3條，并整理出3類DR序列，長度為30～38bp。另外3類DR均可形成回文結(jié)構(gòu)，體現(xiàn)了CRISPR結(jié)構(gòu)的特殊性，莖區(qū)長度與堿基可能與Spacer的插入有關(guān)；DR與個別遠緣種的高同源性表明其存在水平基因轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，并可能與16S rDNA相比經(jīng)歷了相對不同的進化途徑。CRISPR序列的檢測將對今后針對我國野生嗜熱鏈球菌噬菌體抗性菌株的開發(fā)提供基礎(chǔ)平臺，且由于CRISPR抗噬菌體作用方式為食品級安全，所以對其廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)中是非常有利的。

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