趙春暉，徐 潔，曹 瀛，馮 斌

(1.遼寧師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，遼寧大連 116081;2大連醫(yī)科大學(xué)生物技術(shù)系，遼寧 大連 116044)

藥物中間體S－苯基－L－半胱氨酸的酶法合成

趙春暉1，徐 潔1，曹 瀛1，馮 斌2

(1.遼寧師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，遼寧大連 116081;2大連醫(yī)科大學(xué)生物技術(shù)系，遼寧 大連 116044)

目的 利用在大腸桿菌中高效重組表達(dá)的O－乙酰絲氨酸(硫醇)裂解酶A(OASS－A)合成藥物中間體S－苯基－L－半胱氨酸，并對合成產(chǎn)物進(jìn)行純度及結(jié)構(gòu)鑒定。方法 通過PCR擴(kuò)增目的基因 Cys K，并連接到pET－22b(+)載體上構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒，重組體轉(zhuǎn)到感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行蛋白誘導(dǎo)表達(dá)，重組蛋白采用Ni2+－樹脂柱親和層析純化，利用SDS－PAGE鑒定表達(dá)純化蛋白，通過HPLC對合成產(chǎn)物純度進(jìn)行檢測，應(yīng)用1H NMR技術(shù)對化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。結(jié)果 成功構(gòu)建了OASS－A原核表達(dá)載體，在IPTG誘導(dǎo)下獲得了高效表達(dá)。重組酶高效合成非蛋白質(zhì)氨基酸S－苯基－L－半胱氨酸。合成的化合物以晶體形式析出，采用HPLC和1H NMR技術(shù)對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了鑒定，合成產(chǎn)物的純度為100%。結(jié)論 利用大腸桿菌中重組表達(dá)的OASS－A能夠高效合成藥物中間體S－苯基－L－半胱氨酸。

S－苯基－L－半胱氨酸;酶法合成;O－乙酰絲氨酸(硫醇)裂解酶;非蛋白質(zhì)氨基酸

非蛋白質(zhì)氨基酸(又稱非天然氨基酸)是自然界存在的蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的20種氨基酸以外的其他氨基酸，其在科研和醫(yī)藥領(lǐng)域均有廣泛的用途［1－2］。非蛋白質(zhì)氨基酸豐富了肽鏈的多樣性，為跨越20種天然氨基酸屏障，人工合成蛋白質(zhì)提供了基礎(chǔ)材料。非蛋白質(zhì)氨基酸是國內(nèi)外合成肽類、類肽類藥物的主要成分，是眾多新藥的關(guān)鍵中間體，廣泛用于合成治療老年癡呆癥藥物和肽類止痛藥，制備人體激素類似物，合成NMDA受體藥物、抗腫瘤藥、抗癲癇藥、腦啡呔類藥物等［2－3］。

非蛋白質(zhì)氨基酸的來源有兩個途徑：一是來源于植物或其他生物，二是人工合成。在植物中，已經(jīng)鑒定出超過250種非蛋白質(zhì)氨基酸，它們是天然氨基酸在合成和分解代謝過程中的中間產(chǎn)物，可能參與植物對植食性動物及昆蟲的防御體系［4］;在動物中發(fā)現(xiàn)50多種，在微生物中發(fā)現(xiàn)100多種非蛋白質(zhì)氨基酸。但是，非蛋白質(zhì)氨基酸在植物或其他生物中的含量極低，分離提純困難，所以根本無法應(yīng)用于大量生產(chǎn)。

植物和微生物利用絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(SAT)和O－乙酰絲氨酸(硫醇)裂解酶(OASS)將環(huán)境中的無機(jī)硫還原成－2價的硫，摻入到半胱氨酸中。半胱氨酸的合成通過兩步反應(yīng)完成：第一步是在絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(SAT)催化下，由絲氨酸和乙酰輔酶A合成O－乙酰絲氨酸(O－acetylserine，OAS)(反應(yīng)式1：L－絲氨酸+乙酰輔酶酸+輔酶A)，第二步是在O－乙酰絲氨酸(硫醇)裂解酶(OASS)的催化下，由OAS和硫化物(S2－)合成半胱氨酸(反應(yīng)式2：O－乙酰絲氨酸+硫化物)。OASS能夠利用各種親核試劑和硫醇代替S2－合成出各種非蛋白質(zhì)氨基酸(反應(yīng)式3：O－乙酰絲氨酸+親核試劑白質(zhì)氨基酸 + 醋酸鹽)［5－7］。

非蛋白質(zhì)氨基酸S－苯基－L－半胱氨酸(S－phenyl－L－cysteine，S－PC，CAS：34317－61－8)廣泛應(yīng)用于食品添加劑、化妝品添加劑及醫(yī)藥等各個領(lǐng)域，同時也是一種HIV蛋白酶抑制劑類抗艾滋病藥物的基礎(chǔ)原料，具有重要的藥用價值。本研究利用在大腸桿菌中高效表達(dá)的O－乙酰絲氨酸(硫醇)裂解酶A(OASS－A)，得到大量的活性穩(wěn)定的重組酶(生物催化劑);并獲得高效率合成非蛋白質(zhì)氨基酸的有效途徑。此項(xiàng)研究建立的新模式，可以通過改變親核試劑而用于其他非蛋白質(zhì)氨基酸的合成。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒：大腸桿菌克隆菌株Escherichia coli(E.coli)DH5α、E.coliJM109及表達(dá)菌株 E.coli BL21均由本實(shí)驗(yàn)室保存，原核表達(dá)載體pET－22b(+)為本實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 主要試劑：限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、Taq DNA聚合酶、基因組DNA提取試劑盒、DNA切膠回收試劑盒、DNA Marker等購自寶生物(TaKa-Ra)工程大連有限公司;蛋白Marker購自NEB公司;HisPur鎳螯合樹脂(HisPurtmNi－NTA Resin)及離心柱購自Thermo公司;O－乙酰絲氨酸鹽酸鹽和S－苯基－L－半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)樣品購自Sigma公司;其他試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.2 方 法

1.2.1 目的基因的獲得：應(yīng)用基因組DNA提取試劑盒(MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction Kit Ver.2.0，TaKaRa)提取大腸桿菌E.coliDH5α基因組DNA。

根據(jù)原核表達(dá)載體pET22b(+)和OASS－A基因片段Cys K的序列特點(diǎn)，設(shè)計帶有Nde I、Xho I酶切位點(diǎn)的 PCR引物如下：CysK－N：5＇－CGCCCATATGAGTAAGATTTTTGAAG －3＇;CysK － X：5＇－CCGCTCGAGCTGTTGCAATTC －3＇。以大腸桿菌DH5α基因組 DNA為模板，使用 TaKaRa Taq HS PCR擴(kuò)增獲得帶有NdeI、XhoI酶切位點(diǎn)的Cys K基因片段。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性2 min;94℃變性 1 min，65℃退火1 min，72延伸1 min，循環(huán)30次，72℃ 延伸 5 min。PCR產(chǎn)物使用 TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0切膠回收，命名為N－Cys K－X。

1.2.2 原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及誘導(dǎo)表達(dá)：N－Cys K－X基因片段與載體pET－22b(+)分別用Nde I和Xho I雙酶切處理，酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接后轉(zhuǎn)入克隆菌E.coliJM109，并進(jìn)行菌落PCR篩選陽性克隆，隨后提質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定及測序。重組質(zhì)粒由生工生物工程(上海)有限公司測序。

測序后的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)菌E.coliBL21(DE3)中進(jìn)行蛋白表達(dá)。挑選單克隆后，接種于含有氨芐的LB培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)至OD600≈0.6，加IPTG至終濃度1 mmol/L，進(jìn)行12 h的誘導(dǎo)表達(dá)。得到的菌體冰浴超聲破菌，采用鎳柱親和層析純化蛋白，SDS－PAGE電泳鑒定。

1.2.3 OASS的酶活力分析：O－ 乙酰絲氨酸(硫醇)裂解酶(OASS)的活力單位定義為：在25℃，pH 7.5條件下，1 min內(nèi)催化生成1μmol/L半胱氨酸的酶量。OASS活性的測定方法：取0.03 mL 200 mmol/L OAS溶液，加入到0.27 mL的反應(yīng)混合液中，反應(yīng)混合液包括 0.11 mmol/L PLP、2.2 mmol/L Na2S和適量的酶(用緩沖液A稀釋到適當(dāng)濃度)的緩沖液A，調(diào)節(jié)pH值到7.5。反應(yīng)5 min后，加入0.15 mL 20%(w/v)的三氯醋酸終止反應(yīng)，然后加入0.3mL的濃醋酸和0.6mL的茚三酮試劑。混合液煮沸10 min，立刻加入1.8 mL預(yù)冷的乙醇。通過檢測560 nm處光吸收值來測定半胱氨酸的濃度。

1.2.4 S－苯基 －L－半胱氨酸的合成：參考相關(guān)文獻(xiàn)［1－2］合成目標(biāo)化合物(反應(yīng)式4：OAS+thiophe-在50 mL反應(yīng)瓶中加入pH 7.0，50 mmol/L磷酸緩沖液，再依次加入終濃度為20 mmol/L的苯硫酚(Thiophenol)，5 mmol/L OAS，0.1 mmol/L PLP，和400 U/mL的OASS－A，總體積為10 mL。滴加濃鹽酸保持pH 7.0，保溫反應(yīng)2 h，HPLC監(jiān)測原料消耗完畢后，將反應(yīng)液降溫至－20℃，白色晶體析出，抽濾，洗滌，干燥，稱重。

1.2.5 S－苯基－L－半胱氨酸的鑒定：S－苯基－L－半胱氨酸的HPLC譜圖的具體分析條件包括：進(jìn)樣量為5μL;檢測時間為60 min;檢測波長為220 nm;色譜柱型號為Discovery C18 column(250×4.6 mm I.D.);流速為 1.0 mL/min;流動性 Buffer A 為0.10%TFA+H2O;流動相 Buffer B 為 0.10%TFA+CH3CN;梯度洗脫條件為0.1% ～50%B，0～15 min。采用1H NMR(AVANCE500MHz超導(dǎo)核磁共振譜儀，瑞士Bruker公司)技術(shù)對所合成化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。

2 結(jié)果

2.1 OASS－A原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

以大腸桿菌DH5α基因組DNA為模板，用PCR擴(kuò)增帶有Nde I和Xho I酶切位點(diǎn)的Cys K基因片段N－Cys K－X，產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，片段大小為985 bp(圖1)。將N－Cys K－X基因片段克隆入原核表達(dá)載體PET－22b(+)后，經(jīng)Nde I和Xho I雙酶切，得到985 bp目的片段(圖2)。測序結(jié)果顯示載入基因序列未發(fā)生變異，說明成功將Cys K基因構(gòu)建入到pET－22b(+)中。

圖1 N－Cys K－X PCR擴(kuò)增片段電泳圖Fig 1 PCR of N－Cys K－XM：DL2000 DNA Maker;1：Cys K的PCR擴(kuò)增

2.2 重組OASS－A的獲得及鑒定

圖2 pET22b(+)－Cys K雙酶切鑒定Fig 2 Enzyme digestion of pET22b(+)－Cys KM：DL5000 DNA Maker;1：重組質(zhì)粒pET22b(+)－Cys K雙酶切

含有表達(dá)載體pET22b(+)－Cys K的工程菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后提取蛋白，SDS－PAGE電泳表明：經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的總蛋白中，在33kD可以見到明顯的OASS－A表達(dá)條帶(圖3泳道2)，而沒加IPTG誘導(dǎo)的總蛋白中未見相應(yīng)的條帶(圖3泳道1)。目的蛋白OASS－A以可溶性蛋白的形式存在于上清液中，重組蛋白約占總蛋白的55%。OASS－A的分子量與軟件預(yù)測的相同。利用鎳親和層析柱純化后獲得了高濃度的純化OASS－A蛋白(圖3泳道3)。經(jīng)檢測其酶的活性單位為750 U/mg。

圖3 OASS－A表達(dá)和純化的SDS－PAGE結(jié)果Fig 3 SDS－PAGE analysis of expression and purification of OASS－AM.蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn);1：無IPTG誘導(dǎo)OASS－A表達(dá)(對照);2：IPTG誘導(dǎo)OASS－A表達(dá);3：純化的OASS－A

2.3 S－苯基－L－半胱氨酸的鑒定

重組OASS－A合成的S－苯基－L－半胱氨酸以白色晶體析出，經(jīng)過抽濾，洗滌，干燥，稱重得固體粉末8.5 mg。分別進(jìn)樣標(biāo)準(zhǔn)品溶液、樣品溶液和流動相空白溶液，按照色譜條件分別測定。HPLC檢測結(jié)果顯示：S－苯基－L－半胱氨酸的保留時間在9.789 min左右，空白溶液在該時間無吸收。樣品溶液在該時間有吸收峰，且純度為100%。當(dāng)在樣品溶液中加入標(biāo)準(zhǔn)品后測定，僅是峰值增大，未發(fā)生峰分裂，表明該峰為S－苯基－L－半胱氨酸的特征峰，如圖4所示。

圖4 S－苯基－L－半胱氨酸HPLC色譜圖Fig 4 HPLC data of S－phenyl－L－cysteine

進(jìn)一步并利用1H NMR對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征，如圖 5，1H NMR 譜數(shù)據(jù)(CDCl3，500Hz)如下：δ7.6(d，J=7.65Hz，2H，苯環(huán) H －3’，H －5’)，7.5(t，J=7.6Hz，2H，苯環(huán) H －2’，H －6’)，7.48(t，J=7.2Hz，1H，苯環(huán) H －4’)，3.9(dd，J1=3.75 Hz，J2=3.8Hz，1H， － CH － COOH)，3.7(dd，J1=3.75Hz，J2=3.8Hz，1H，H － 3)，3.38(dd，J1=8.7Hz，J2=8.65Hz，1H，H －3)。

圖5 S－苯基－L－半胱氨酸1 H NMR譜圖Fig 5 1 H NMR spectrum of S－phenyl－L－cysteine

3 討論

近年來，以非蛋白質(zhì)氨基酸為“建筑材料”合成“人工蛋白質(zhì)”是新興的科學(xué)領(lǐng)域。由設(shè)計組裝的生物元件與系統(tǒng)使生物體執(zhí)行新的功能，在醫(yī)學(xué)、制藥、化工、能源、材料、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域都有廣闊的應(yīng)用前景和極大的應(yīng)用潛力［6－7］。以非蛋白質(zhì)氨基酸為元件合成肽類、類肽類藥物［4，8］，以及為研究和控制細(xì)胞內(nèi)的生化過程而將非蛋白質(zhì)氨基酸引入類病毒或真核細(xì)胞等方面的研究都取得了很多進(jìn)展［9－11］。但在非蛋白質(zhì)氨基酸元件本身的合成方面的研究卻非常少。非蛋白質(zhì)氨基酸的生產(chǎn)要遠(yuǎn)比蛋白質(zhì)氨基酸的生產(chǎn)復(fù)雜并且昂貴得多［3，12－13］。

人工合成是非蛋白質(zhì)氨基酸生產(chǎn)的可行途徑，包括化學(xué)合成和生物催化合成。由于化學(xué)合成法存在底物合成復(fù)雜，催化劑昂貴，成本高，副產(chǎn)物多，反應(yīng)條件復(fù)雜，純化步驟復(fù)雜等問題，使生物催化在生產(chǎn)中占有越來越重要的地位。生物催化反應(yīng)的特點(diǎn)是反應(yīng)立體選擇性強(qiáng)，反應(yīng)條件溫和，大部分是在水相進(jìn)行的，是一種綠色的合成工藝。采用生物技術(shù)提高酶的產(chǎn)量、活性、選擇性及適應(yīng)性，提高目標(biāo)代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)效率和生產(chǎn)能力將使生物催化得到更為廣泛的應(yīng)用。同時，酶法合成的非蛋白質(zhì)氨基酸純度高，效率高，比生物發(fā)酵的方法有更大的優(yōu)勢。

本實(shí)驗(yàn)中攜帶重組質(zhì)粒pET22b(+)－Cys K的菌體高效地表達(dá)了研究所需要的目的蛋白OASS－A，并以可溶性蛋白的形式存在于上清液中，重組蛋白約占總蛋白的55%。菌體破碎后，經(jīng)離心得到酶的粗提液，測得OASS－A的比活性為400 U/mg。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，采用酶的粗提液同樣能夠高效合成S－苯基－L－半胱氨酸。合成的化合物以晶體形式析出，具有產(chǎn)物純度高、耗能低、工藝簡單、便于操作、粒度分布較窄且易于規(guī)模化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。

酶的生物催化很大程度上依賴于特定性能酶的開發(fā)，因此能否提高酶的產(chǎn)量、活性、穩(wěn)定性及適應(yīng)性，解決酶來源受限的問題非常關(guān)鍵。本研究獲得的重組酶產(chǎn)量高，活性穩(wěn)定，對溫度和pH適應(yīng)范圍廣［14］，在溫度為0 ～60℃、pH 7.0 ～9.5 范圍內(nèi)都可以保持高效的催化活性。說明OASS－A極有可能成為生物催化合成非蛋白質(zhì)氨基酸的有效工具酶。通過改變親核試劑可以使建立的新模式應(yīng)用于其他各種非蛋白質(zhì)氨基酸的合成，從而為應(yīng)用生物技術(shù)生產(chǎn)各種非蛋白質(zhì)氨基酸提供理論依據(jù)。

致謝：核磁共振譜圖測試得到了趙龍鉉老師的幫助，在此表示衷心的感謝!

［1］Zhao C，Ohno K，Sogoh K，et al.Production of nonproteinaceous amino acids using recombinantEscherichia colicells expressing cysteine synthase and related enzymeswith or without the secretion ofO－acetyl－L－serine［J］.J Biosci Bioeng，2004，97(5)：322－328.

［2］ Maier TH.Semisynthetic production of unnatural L－alpha－amino acids bymetabolic engineering of the cysteine －biosynthetic pathway［J］.Nat Biotechnol，2003，21(4)：422－427.

［3］王德心.活性多肽與藥物開發(fā)［M］.第1版，北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2008：46－61.

［4］Swain，T.Secondary compounds as protective agents［J］.Annu Rev Plant Physiol，1977，28：479 －501.

［5］Zhao C，Moriga Y，F(xiàn)eng B，et al.On the interaction site of serine acetyltransferase in the cysteine synthase complex fromEscherichia coli［J］.Biochem Biophys Res Commun，2006，341(4)：911－916.

［6］Ayyadurai N，Deepankumar K，Prabhu NS，et al.A facile and efficientmethod for the incorporation ofmultiple unnatural amino acids into a single protein［J］.Chem Commun(Camb)，2011，47(12)：3430－3432.

［7］Wang L，Brock A，Herberich B，et al.Expanding the genetic code ofEscherichia coli［J］.Science，2001，292(5516)：498－500.

［8］Gentilucci L，De Marco R，Cerisoli L.Chemicalmodifications designed to improve peptide stability：incorporation of non－natural amino acids，pseudo－peptide bonds，and cyclization［J］.Curr Pharm Des，2010，16(28)：3185－3203.

［9］Hutchins BM，Kazane SA，Staflin K，et al.Site－specific coupling and sterically controlled formation of multimeric antibody fab fragments with unnatural amino acids［J］.J Mol Biol，2011，406(4)：595 －603.

［10］Liu CC，Qi L，Yanofsky C，etal.Regulation of transcription by unnatural amino acids［J］.Nat Biotechnol，2011，29(2)：164－168.

［11］Ugwumba IN，Ozawa K，Xu ZQ，etal.Improving a natural enzyme activity through incorporation of unnatural amino acids［J］.J Am Chem Soc，2011，133(2)：326 －333.

［12］Boto A，Gallardo JA，Hernández D，et al.Synthesis of unnatural amino acids from serine derivatives by betafragmentation of primary alkoxyl radicals［J］.JOrg Chem，2007，72(19)：7260－7269.

［13］Gellett AM，Huber PW，Higgins PJ.Synthesis of the unnatural amino acid N－N－(ferrocene－1－acetyl)－llysine：a novel organometallic nuclease［J］.JOrganomet Chem，2008，693(18)：2959－2962.

［14］Zhao C，Kumada Y，Imanaka H，et al.Cloning，overexpression，purification，and characterization ofO－acetylserine sulfhydrylase－B fromEscherichia coli［J］.Protein Expr Purif，2006，47(2)：607 －613.

Enzymatic synthesis of pharmaceutical intermediates S－phenyl－L－cysteine

ZHAO Chun － hui1，XU Jie1，CAO Ying1，F(xiàn)ENG Bin2
(1.College of Life Science，Liaoning Normal University，Dalian 116081，China;2.Department of Biotechnology，Dalian Medical University，Dalian 116044，China)

Objective To construct expression vector of O －acetylserine sulfhydrylase A(OASS－A)，purify and determine its chemical structure.Methods Full－length Cys K gene was amplified by polymerase chain reaction(PCR)and ligated with pET－22b(+)expression vector to construct prokaryotic expression plasmid.The recombinantwas transformed into competent E.coli BL21(DE3)for protein expression with IPTG induction.Recombinant protein was purified with Ni2+－resin affinity chromatography and identified by SDS－PAGE.The purity and chemical structure of the synthesized compound were determined using HPLC and1H NMR techniques.Results The prokaryotic expression vector for OASS － A was successfully constructed and fusion protein was expressed at a high level with IPTG induction.The unnatural amino acids S－phenyl－L－cysteinewas effectively synthesized by recombinantOASS－A.Conclusion The pharmaceutical intermediate S－phenyl－L－cysteine was effectively synthesized by recombinant OASS－A from E.coli.

S－phenyl－L－cysteine;enzymatic synthesis;O－acetylserine sulfhydrylase;unnatural amino acids

Q599

A

1671－7295(2013)01－0018－05

10.11724/jdmu.2013.01.04

國家自然科學(xué)基金(21102067，81071248)

趙春暉(1974 －)，女，遼寧營口人，副教授。E －mail：chunhuiz@hotmail.com

馮 斌，副教授。E－mail：binfeng70@hotmail.com

趙春暉，徐潔，曹瀛，等.藥物中間體S－苯基－L－半胱氨酸的酶法合成［J］.大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2013，35(1)：18 －22.

2012－10－08;

2012－12－04)