衛(wèi)福磊，李長忠，史建全，祁得林，梁健，謝保勝，趙蘭英，祁洪芳

(1.青海大學生態(tài)環(huán)境工程學院，西寧 810016;2.青海湖裸鯉救護中心，西寧 810016;3.青海大學農牧學院，西寧 810016)

青海湖裸鯉(Gymnocypris przewalskii)俗稱湟魚，屬鯉形目(Cypriniformes)，鯉科(Cyprinidae)，裂腹魚亞科(Schizothoracinae)，裸鯉屬，是青海湖中唯一的水生經濟動物，處于青海湖整個生態(tài)系統(tǒng)的核心地位。青海湖地處海拔三千多米的高原上，水溫低，餌料生物貧乏，故此魚生長緩慢，生長300～500 g 平均需要7～10 年時間。它是國家二級保護魚類，1998 年被《中國瀕危動物紅皮書》列為瀕危物種［1］。青海湖裸鯉屬于洄游產卵型魚類，每年從青海湖洄游至淡水河流中產卵繁殖，環(huán)境的改變促使洄游的青海湖裸鯉也發(fā)生一系列適應性的變化［2，3］。在過去的50 年里，由于青海湖鹽度的增加［4］、人工過度捕撈以及生長緩慢等原因，野生青海湖裸鯉存儲量從1960 年的20 ×104噸［5］減少到了現在不足0.5 ×104噸［6］。實踐證明，青海湖裸鯉的人工增殖、放流是一種保護和恢復青海湖裸鯉資源的有效方法。積極開展青海湖裸鯉基礎生物學特征和對低氧、低溫、鹽堿環(huán)境適應的分子機理的研究，有助于揭示青海湖裸鯉的基本生命活動規(guī)律，為該魚種的資源保護和人工、增殖放流提供理論依據。

3－磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde－3－phosphate dehydrogenase，GAPDH)是糖酵解途徑中的一個關鍵酶，是一種多功能性蛋白。在大部分物種中由于GAPDH 具有高度種屬保守序列，在很多組織中都高水平表達，且表達量一般相對恒定，故常被用作RT－PCR、Western blot 等實驗操作的內源參照基因［7］。但是，近年來的研究也發(fā)現GAPDH 的表達水平并不穩(wěn)定，在不同動物中利用它作為內標來進行半定量分析受到質疑［8－10］。因此，進行青海湖裸鯉生理適應的分子機理的研究，有必要了解GAPDH作為內標的可靠性。

GAPDH 參與多種細胞功能的調節(jié)，例如DNA修復［11］、tRNA 出核過程［12］、膜融合與運輸作用［13，14］以及細胞凋亡等。根據Hara 的研究，GAPDH 參與的細胞凋亡涉及NO－巰基亞硝基化－GAPDH－Siah 途徑，即經巰基亞硝基化的GAPDH 可以特異的與E3－泛素連接酶Siah 形成復合體進入細胞核，進入細胞核后的Siah 使細胞核蛋白質降解，促進了細胞凋亡作用［15，16］。另一方面，蛋白激酶B 可以對GAPDH 蛋白237 位蘇氨酸磷酸化而抑制其向細胞核轉移，阻止GAPDH 介導的細胞凋亡作用［17］。此外還發(fā)現GAPDH 能夠特異地與肌醇1，4，5－三磷酸受體結合，并且在代謝過程中產生的NADH 能夠進一步調節(jié)內質網中Ca2+的釋放［18］，通過鈣離子信號通路對于細胞增殖、分化、凋亡進行調控。盡管對于GAPDH 結構和分子催化基本特征方面取得了一定進展，但是對于其功能調節(jié)的機制卻知之甚少。掌握青海湖裸鯉GAPDH 分子的序列和結構特征，有助于全面了解GAPDH 在青海湖裸鯉環(huán)境適應方面的作用機制。

本研究利用RT－PCR 和RACE 方法得到了青海湖裸鯉3－磷酸甘油醛脫氫酶旁系同源體基因(Gp-GAPDHα、Gp-GAPDHβ)cDNA 全長序列，通過序列特征分析及其在不同組織和受精卵不同發(fā)育階段表達水平研究，初步掌握了GAPDH 作為內標的可靠性，并為GAPDH 在青海湖裸鯉適應性調節(jié)機制的進一步研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

青海湖裸鯉取自青海湖裸鯉救護中心原種培育基地養(yǎng)殖場(青海，西寧)，均為淡水池塘養(yǎng)殖的2+齡雌魚，體重300～500 g，體長27～35 cm。試驗用魚運回實驗室后暫養(yǎng)于裝滿淡水養(yǎng)殖箱中。隨機選取健康的青海湖裸鯉3 條以上個體用于實驗，取青海湖裸鯉不同組織于液氮中保存。青海湖裸鯉胚胎發(fā)育不同階段取自青海湖裸鯉救護中心剛察孵化站，青海湖裸鯉卵細胞人工受精后于淡水中孵化，孵化用水引自沙柳河(青海，西寧)，為地表徑流水，水溫保持在13～17℃，溶氧量＞5.0 mg/L。

主要試劑:Ex Taq 酶、pMD19－T 載體、RNA 提取試劑RNAiso Plus reagent、PrimeScript RTase Kit、5‘Full RACE Kit 和3′Full RACE Core Set Ver.2.0 購自寶生物工程有限公司(大連)，瓊脂糖凝膠回收試劑盒、DNA marker 購自生工生物工程有限公司(上海)。

1.2 實驗方法

1.2.1 總RNA 的提取和GAPDH 基因快速擴增(RACE)cDNAs 末端模板制備

取于液氮中保存的鰓組織液氮研磨，加入RNAiso Plus reagent 中提取RNA。對于提取的總RNA 樣品進行定量并電泳檢測后，依照PrimeScript RTase Kit、5′ Full RACE Kit 和3′ Full RACE Core Set Ver.2.0 分別制備RT－PCR 和RACE 擴增模板。

1.2.2 Gp-GAPDH 基因特異性片段的擴增

根據斑馬魚、大西洋鮭魚等已知的GAPDH 基因保守cDNA 序列設計引物GAPDHF1 和GAPDHR1(表1)，以青海湖裸鯉第一鏈cDNA 為模板，擴增得到Gp-GAPDHα 基因特異性片段。使用GAPDHF1 和GAPDHR1 為RACE 引物進行Gp-GAPDH基因末端擴增，卻同時得到兩種堿基存在明顯差異的基因序列，分別命名為 Gp-GAPDHα 和 Gp-GAPDHβ。

1.2.3 Gp-GAPDHα 基因全長擴增

依照5′ Full RACE Kit 說明，使用引物Gp－GAPDHαR1(表1)與5′ RACE inner primer(Takara，Kyoto，Japan)為擴增引物，5′ RACE 產物為模板，進行PCR 擴增得到5′端非編碼區(qū)。同時，以3′ RACE產物為模板，使用引物Gp－GAPDHαF1(表1)與3′RACE inner primer(Takara，Kyoto，Japan)進行PCR擴增得到Gp-GAPDHα 基因3′端非編碼區(qū)。對上述獲得的序列進行拼接，根據拼接序列在基因序列3′端非編碼區(qū)與 5′ 端非編碼區(qū)設計引物 GPGAPDHαF2 和GP－GAPDHαR2(表1)進行驗證PCR反應。

1.2.4 Gp-GAPDH β 基因全長擴增

設計用于Gp-GAPDH β 基因5′ RACE 擴增的特異引物Gp－GAPDHβR1(表1)與3′ RACE 擴增的特異引物Gp－GAPDHβF1(表1)分別與5′ RACE Inner Primer 和3′ RACE inner Primer 進行PCR 擴增得到5′端非編碼區(qū)及3′端非編碼區(qū)。對上述獲得的序列進行拼接得到Gp-GAPDHβ 基因全長序列，根據拼接序列在基因序列3′端非編碼區(qū)與5′端非編碼區(qū)設計引物GP－GAPDHβF2 和GP－GAPDHβR2(表1)進行驗證PCR 反應。

表1 PCR 所使用的引物名稱與引物序列Tab.1 Primer names and sequences used in the PCR

1.2.5 Gp-GAPDH 基因序列分析

利用在線工具ExPaSy(http://www.expasy.ch/tools/dna.html)進行蛋白質序列基本性質預測。使用在線工具Intropro 進行蛋白質結構域預測。不同物種的GAPDH 氨基酸序列下載于GenBank 數據庫，通過分析軟件Vector NTI(Infor－Max，Frederick，USA)進行同源性比較及系統(tǒng)進化樹(NJ 法)的構建。

1.2.6 Gp-GAPDHα 與Gp-GAPDHβ 基因在青海湖裸鯉不同組織中的表達水平檢測

提取青海湖裸鯉心臟、腦、鰓、肌肉、腎臟和卵巢6 種組織總RNA。由于Gp-GAPDHα 與Gp-GAPDHβ編碼區(qū)相似度較高，為避免引物非特異性結合，根據各自3′端非編碼區(qū)設計Gp-GAPDHα 基因半定量RT－PCR 特 異 引 物: semi－GAPDHαF1、 semi－GAPDHαR1、semi－GAPDHβF1 和 semi－GAPDHβR1(表1)。以青海湖裸鯉β-actin 為參照，先后進行3次RT－PCR 實驗。Gp-GAPDHα 與Gp-GAPDHβ 基因PCR 擴增條件為:預變性94℃ 3 min;94℃ 45 s，56℃30 s，72℃25 s，30 循環(huán);72℃10 min。通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳和生物圖形軟件Gel－Pro analyzer 分別檢測其在不同組織中的轉錄水平差異。

1.2.7 Gp-GAPDHα 與Gp-GAPDHβ 基因在青海湖裸鯉受精卵不同發(fā)育階段的表達水平檢測

青海湖裸鯉產沉粘性卵，人工脫粘之后，調控水溫和水流量于溶氧大于5.0 mg/L 流動淡水中孵化，全部仔魚出膜約7 d 左右。于液氮中保存未發(fā)育成熟Ⅳ期卵母細胞、發(fā)育至多細胞期、囊胚期、原腸中期、原腸晚期、神經胚期和器官形成期胚胎，提取各發(fā)育階段總 RNA，使用 RT－PCR 分別檢測 Gp-GAPDHα 與Gp-GAPDHβ 在受精卵不同發(fā)育階段轉錄水平的變化，方法同1.2.3。

1.2.8 統(tǒng)計分析與繪圖

根據Gel－Pro analyzer 對表達條帶密度進行掃描，表達量以均值± 標準誤(mean ± SE)表示，同時使用Minitab(Minitab，USA)統(tǒng)計分析軟件進行方差分析(P＜0.05)。通過Origin 7(OriginLab，USA)繪制柱形圖。

2 結果

2.1 Gp-GAPDHα 與Gp-GAPDHβ 的克隆與序列分析

使用引物GAPDHF1(表1)和GAPDHR1(表1)進行PCR 擴增得到特異性條帶，經測序為Gp-GAPDHα 片段，使用此對引物分別進行5′與3′端RACE 反應，卻得到了序列存在明顯差異的Gp-GAPDHα 與Gp-GAPDHβ 基因3′與5′末端序列。根據已得到末端序列分別設計相應5′與3′端RACE引物，進行末端擴增、序列拼接和驗證PCR，得到Gp-GAPDHα 與Gp-GAPDHβ 基因全長序列。

2.1.1 Gp-GAPDHα 基因克隆

利用引物 Gp－GAPDHαR1 與 5′－RACE inner primer 進行PCR 擴增，得到Gp-GAPDHα 基因526 bp 的5′端序列。利用引物Gp－GAPDHαF1 與3′RACE inner primer 進行PCR 擴增得到長度為854 bp 的3′端序列，序列拼接得到Gp-GAPDHα 基因全長序列共1302 bp。使用 GP－GAPDHαF2 和 GPGAPDHαR2 進行驗證性PCR 擴增獲得包含Gp-GAPDHα 編碼區(qū)全長的基因序列共1070 bp(圖1)，GenBank 注冊號為:JX287372。

2.1.2 Gp-GAPDHβ 基因克隆

使用引物 Gp－GAPDHβR1 與5′ RACE Inner Primer 進行PCR 擴增得到5′端序列458 bp，引物Gp－GAPDHβF1 與3′ RACE inner Primer 進行PCR擴增得到3′端序列1203 bp。序列拼接得到Gp-GAPDHβ 基因全長序列共1403 bp，根據拼接序列在基因序列3′端非編碼區(qū)與5′端非編碼區(qū)設計引物GP－GAPDHβF2 和GP－GAPDHβR2 進行驗證PCR 反應，獲得包括Gp-GAPDHβ 編碼區(qū)全長基因序列共1167 bp(圖2)。GenBank 注冊號為:JX287373。

圖1 Gp-GAPDHα 基因的克隆Note:M.Marker;1.PCR product of 5′RACE;2.PCR product of 3′RACE;3.PCR product of confirming PCR.Fig.1 Gene clones of Gp-GAPDHα.

圖2 Gp-GAPDHβ 基因的克隆Note:M.Marker;1.PCR product of 5′RACE;2.PCR product of 3′RACE;3.PCR product of confirming PCRFig.2 Gene clones of Gp-GAPDHβ

2.2 序列分析

如圖3A，Gp-GAPDHα 基因全長序列由70 bp 的5′端非編碼區(qū)、1002 bp編碼區(qū)和230 bp 的3′端非編碼區(qū)序列構成。Gp-GAPDHα 基因開放性讀碼框包含1002 bp核苷酸序列，編碼333 個氨基酸，該蛋白分子量為35.7 ×103，等電點為8.73，不含信號肽序列。Gp－GAPDHα 蛋白序列與硬骨魚GAPDH 蛋白序列同源性分別為:斑馬魚95%(Dr－GAPDH1)和74%(Dr－GAPDH2);石鯛魚91%(Rb－GAPDH1)和73%(Rb－GAPDH2)。與人類GAPDH 蛋白序列同源性為84%(Hs－GAPDH1)和74%(Hs－GAPDH2)(表2)。

如圖3B，Gp-GAPDHβ 基因全長序列由67 bp 的5′端非編碼區(qū)、1008 bp編碼區(qū)和328 bp 的3′端非編碼區(qū)序列構成。Gp-GAPDHβ 基因開放性讀碼框包含100 bp 核苷酸序列，其編碼335 個氨基酸，該蛋白分子量為36.0 kDa，等電點為6.58，不含信號肽序列。Gp－GAPDHβ 蛋白序列與硬骨魚GAPDH 蛋白序列同源性分別為:斑馬魚73%(Dr－GAPDH1)和97%(Dr－GAPDH2);石鯛魚73%(Rb－GAPDH1)和92%(Rb－GAPDH2)。與人類GAPDH 蛋白序列同源性為73%(Hs－GAPDH1)和66%(Hs－GAPDH2)(表2)。

圖3 (A)青海湖裸鯉GAPDH 旁系同源體編碼基因Gp-GAPDHα 及氨基酸序列Note:Gp－GAPDH has a putative NAD + binding domain(shaded)，a conserved catalytic domain(underlined)and GAPDH active site(bold and italic).Fig.3 (A)cDNA sequences and deduced amino acid sequences of G.przewalskii glyceraldehyde 3－phosphate dehydrogenase paralogue isoforms:Gp-GAPDHα.

圖3 (B)青海湖裸鯉GAPDH 旁系同源體編碼基因Gp-GAPDHβ 及氨基酸序列Note:Gp－GAPDH has a putative NAD + binding domain(shaded)，a conserved catalytic domain(underlined)and GAPDH active site(bold and italic).Fig.3 (B)cDNA sequences and deduced amino acid sequences of G.przewalskii glyceraldehyde 3－phosphate dehydrogenase paralogue isoforms:Gp-GAPDHβ.

表2 不同物種GAPDH 氨基酸序列比對及NJ 法構建進化樹Tab.2 Phylogenetic reconstruction using Neighbor－joining(NJ)method with G.przewalskii glyceraldehyde 3－phosphate dehydrogenase isoform α(Gp－GAPDHα)and isoform β(Gp－GAPDHβ)with those of other species

注:GenBank 登錄號:GpGAPDHα，GAPDH［青海湖裸鯉］(JX287372);GpGAPDHβ，GAPDH［青海湖裸鯉］(JX287373);DrGAPDH1，GAPDH［斑馬魚］(NP_001108586.1);DrGAPDH2，GAPDH［斑馬魚睪丸型］(NP_998259.1);RbGAPDH1，GAPDH［石鯛1］(ACF35052.1);RbGAPDH2，GAPDH［石鯛2］(ACF35053.1);HsGAPDH1，GAPDH［人類1］(NP_002037.2);HsGAPDH2，GAPDH［人類2］(NP_001243728.1)。Note:GenBank accession numbers are as follows:GpGAPDHα，GAPDH［Gymnocypris przewalskii］(JX287372);GpGAPDHβ，GAPDH［Gymnocypris przewalskii］(JX287373);DrGAPDH1，GAPDH［Danio rerio］(NP_001108586.1);DrGAPDH2，GAPDH［Danio rerio］(NP_998259.1);Rb－GAPDH1，GAPDH［Oplegnathus fasciatu］(ACF35052.1);RbGAPDH2，GAPDH［Oplegnathus fasciatus］(ACF35053.1);HsGAPDH1，GAPDH［Homo sapiens1］(NP_002037.2);HsGAPDH2，GAPDH［Homo sapiens］(NP_001243728.1).

2.3 Gp-GAPDHα 與Gp-GAPDHβ 表達模式的研究

2.3.1 Gp-GAPDHα 與Gp-GAPDHβ 在青海湖裸鯉不同組織中表達量分析

圖4 不同組織中Gp-GAPDH 表達模式Note:1.Heart;2.Brain;3.Gill;4.Muscle;5.Kidney;6.OvaryFig.4 Expression pattern of Gp-GAPDH in different tissues

以β-actin 基因的表達作參比，轉錄水平用三次Gp-GAPDHα 與Gp-GAPDHβ 分別對參比基因密度的比值所得的(±s)表示。如圖4，圖的上部為三次電泳結果之一，不同組織中Gp-GAPDHα 與Gp-GAPDHβ的表達量方差分析結果表明，Gp-GAPDHα 在心臟和腦組織中表達量最高且表達量相似，鰓、肌肉、腎臟中表達量相似但相對較低，在卵巢中表達量適中(P＜0.05)。Gp-GAPDHβ 在鰓組織中的表達量最多，在心臟、肌肉、腎臟和卵巢組織中表達量差異不大，在腦組織中表達量最少(P＜0.05)。

2.3.2 青海湖裸鯉胚胎發(fā)育不同階段Gp-GAPDHα與Gp-GAPDHβ 表達量的分析

以青海湖裸鯉β-actin 為參照，對Gp-GAPDHα 與Gp-GAPDHβ 在青海湖裸鯉胚胎發(fā)育不同階段的表達量變化進行分析。如圖5，方差分析結果表明，Gp-GAPDHα 在4 期卵母細胞、多細胞期、原腸中期、原腸晚期、神經胚期和器官形成期表達水平差異不顯著，但在囊胚期表達量最高(P＜0.05)。Gp-GAPDHβ在青海湖裸鯉胚胎不同發(fā)育階段表達量的差異較大，即在未成熟的卵細胞和器官形成期表達量最高，從卵細胞受精至神經胚期之間表達量很小(P＜0.05)。

3 討論

本研究報道了青海湖裸鯉3－磷酸甘油醛脫氫酶兩種旁系同源體基因Gp-GAPDHα 和Gp-GAPDHβ 的全長cDNA 序列，兩者的氨基酸序列與其他物種存在廣泛的同源性。通過對兩種基因在不同組織和受胚胎不同發(fā)育階段中轉錄水平的研究，初步分析其作為參照基因的可靠性。

圖5 胚胎發(fā)育不同階段Gp-GAPDH 表達模式Note:1.Oocytes of phase 4;2.Multicellular stage;3.Blastula stage;4.Middle gastrula stage;5.Late gastrula stage;6.Neurula stage;7.Period of organogenesis.Fig.5 Expression pattern of Gp-GAPDH at different stages of embryogenesis

人體存在兩種相似的GAPDH 基因，分別為Hs－GAPDH1 和Hs－GAPDH2，其中Hs－GAPDH1 廣泛分布與不同組織中，而Hs－GAPDH2 為睪丸組織特異性表達。在石鯛魚中同樣發(fā)現GAPDH 存在兩種旁系同源體，Rb－GAPDH1 和Rb－GAPDH2，分別編碼333和335 個氨基酸序列，普遍分布于不同組織中，兩者的相似性為74%［19］。本次實驗克隆得到的Gp－GAPDHα 和 Gp－GAPDHβ 與 Rb－GAPDH1 和 Rb－GAPDH2 相似度分別為91%和92%，這說明硬骨魚中兩種GAPDH 旁系同源體是普遍存在的，而與哺乳動物存在一定差異。進一步對Gp－GAPDHα 和Gp－GAPDHβ 與斑馬魚三磷酸甘油醛脫氫酶序列Dr－GAPDH1 和Dr－GAPDH2 進行相似性比較，發(fā)現Gp－GAPDHβ 與斑馬魚睪丸型Dr－GAPDH2 更加相似(97%)。已有的研究表明，GAPDH 旁系同源體在脊索動物早期進化中通過基因復制而出現，GAPDH2在大部分物種進化中丟失，僅存在于蜥蜴類、哺乳動物和魚類，在魚類不同組織都有分布［20］。

通過蛋白質結構域預測分析表明，Gp－GAPDHα、Gp－GAPDHβ 蛋白具有GAPDH 蛋白基本結構域:NAD+結合結構域和保守的催化結構，同時還包括一個保守的GAPDH 活性位點(圖3)。所得到的兩種Gp-GAPDH 旁系同源體基因存在明顯差異，雖然兩種推測編碼蛋白都具有3－磷酸甘油醛脫氫酶特征性催化結構域和NAD+結合結構，但是同源性卻只為74%，等電點差異更大，分別為:Ip(Gp－GAPDHα):8.73，Ip(Gp－GAPDHβ):6.58。在青海湖裸鯉同時存在這兩種Gp－GAPDH 旁系同源體，它們的功能及其差異需要進一步研究。

β-actin 經常作為參照基因對目的基因表達量進行校正，根據對于硬骨魚的研究中發(fā)現，β-actin 更適合作為參照基因使用，在牙鲆不同發(fā)育階段的內參基因選擇過程中發(fā)現，GAPDH 的表達差異相當顯著，而β-actin 基因相對較穩(wěn)定［10］。通過黃花魚的研究發(fā)現，β-actin 是在免疫反應中表達量比較穩(wěn)定的基因，可以作為對照基因［21］。通過RT－PCR 檢測半滑舌鰨在內毒素物質刺激條件下β-actin 在不同組織中表達量，并未發(fā)現明顯差別，認為其可作為可靠的參照基因使用［22］。因此，本研究以β-actin 為參照基因對于Gp-GAPDHα 與Gp-GAPDHβ 表達水平進行分析，結果顯示，Gp-GAPDHα 與Gp-GAPDHβ 在青海湖裸鯉不同組織和受精卵發(fā)育不同階段表達量存在較大差異，尤其Gp-GAPDHβ 在胚胎發(fā)育不同階段差異顯著。初步斷定Gp-GAPDHβ 不適合作為參照基因，而Gp-GAPDHα 表達穩(wěn)定性需要進一步研究，選擇其作為參照基因需謹慎。

魚類胚胎發(fā)育通常需經歷卵裂期、囊胚期、原腸胚期、神經胚器和器官形成期后進入孵化階段，當魚類受精卵細胞發(fā)育至器官形成期，細胞進入分化與凋亡活動更加活躍的階段。在以小鼠為模式動物的研究中，Schlisser 發(fā)現在小鼠胚胎器官形成期，GAPDH 介導致畸劑Teratogen 產生的氧化脅迫從而導致小鼠畸形［23］，我們推測GAPDH 在魚類受精卵的正常發(fā)育過程中起著重要的作用，兩種異形體的功能需要做進一步研究。

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