鮑丹，董偉，劉寧，張旭，呂丹，張連峰

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動(dòng)物模型三級實(shí)驗(yàn)室，北京 100021)

高血壓是嚴(yán)重危害人類健康的常見心血管病之一，目前全球高血壓患者約有10 億，如不采取積極有效的預(yù)防措施，預(yù)計(jì)到2025 年，全球的高血壓患者可能會(huì)再增加80%［1］。因此，高血壓的防治具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

多巴胺是由交感神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生的主要的兒茶酚胺類物質(zhì)之一，當(dāng)腎臟鈉濃度升高時(shí)，局部產(chǎn)生的多巴胺通過與腎近曲小管上的D1和D2樣受體結(jié)合，抑制鈉的重吸收，促進(jìn)尿鈉排泄，調(diào)節(jié)血壓。研究發(fā)現(xiàn)，遺傳性高血壓大鼠和人類原發(fā)性高血壓患者腎臟多巴胺功能均受損［2－5］，原因是多巴胺D1受體(dopamine D1receptor，D1R)功能減弱，其活性受G蛋白偶聯(lián)受體激酶(G－protein－coupled receptor kinases，GRKs)調(diào)控。G 蛋白偶聯(lián)受體激酶4(G－protein－coupled receptor kinase 4，GRK4)是GRKs 家族成員，編碼GRK4 的基因定位4p16.3，該位點(diǎn)已被證實(shí)與高血壓的發(fā)生相關(guān)［6］。在正常情況下，GRK4 主要在睪丸和子宮肌層中表達(dá)，腦和腎臟組織中表達(dá)低［7－9］;而在自發(fā)性高血壓大鼠和人類原發(fā)性高血壓患者腎臟中GRK4 表達(dá)增高［9］，活性增高的GRK4 一方面可導(dǎo)致腎臟D1R 功能受損，另一方面可增強(qiáng)血管緊張素1 型受體(angiotensin type 1 receptor，AT1R)的功能，從而導(dǎo)致腎臟尿鈉排泄障礙，血壓升高。

已有報(bào)道，GRK4 的突變與腎臟促尿鈉排泄功能受損和高血壓的發(fā)生密切相關(guān)，其中R65L(rs2960306 )、A142V(rs1024323 )和 A486V(rs1801058)是現(xiàn)階段研究頻率較高的三個(gè)突變。研究發(fā)現(xiàn)，GRK4 基因突變的發(fā)生頻率具有種族特異性，如GRK4γR65L和GRK4γA142V在加納人和黑種人中的發(fā)生率較高，而GRK4γA486V在中國人、日本人和白種人中的發(fā)生率較高［10－11］。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在意大利人群中GRK4γA486V同高血壓顯著相關(guān)(P =0.034)［12］。在另一個(gè)在澳大利亞人群中的研究也發(fā)現(xiàn)GRK4γA486V同高血壓密切相關(guān)(P =0.02)，并且還發(fā)現(xiàn)GRK4γR65L和GRK4γA142V與男性舒張壓呈正相關(guān)(P =0.009，P =0.002)［13］。在對中國北方漢族人群的研究中發(fā)現(xiàn)，GRK4γR65L、GRK4γA142V和GRK4γA486V的同時(shí)存在可使高血壓的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)較無突變?nèi)巳焊? 倍［14］。在日本人群中，若GRK4γR65L、GRK4γA142V和GRK4γA486V三個(gè)突變同時(shí)存在，其對鹽敏感性高血壓發(fā)生的預(yù)測準(zhǔn)確率高達(dá)94%［11］。

基于上述現(xiàn)狀，本研究通過建立GRK4γ 野生型和三種GRK4γ 基因突變轉(zhuǎn)基因小鼠，并對其血壓進(jìn)行動(dòng)態(tài)分析。擬為研究GRK4γ 突變與高血壓發(fā)病機(jī)制的關(guān)系提供有價(jià)值的疾病動(dòng)物模型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

C57BL/6J 小鼠和ICR 小鼠購自北京市維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司［SCXK(京)2012－0001］。GRK4γwt/R65L/A142V/A486V轉(zhuǎn)基因小鼠由本實(shí)驗(yàn)室制作［SCXK(京)2013－0002］。本實(shí)驗(yàn)所用動(dòng)物均在無特定病原體(specific－pathogen free，SPF)的飼養(yǎng)間［SYXK(京)2009－0003］飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)中涉及動(dòng)物的操作程序已經(jīng)得到中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用與管理委員會(huì)的批準(zhǔn)(ILAS－GC－2012－001)。

1.1.2 主要試劑及儀器

突變試劑盒購自美國Stratagene 公司。限制性內(nèi)切酶如Nhe I、Xba I 和Pvu I 以及PCR 相關(guān)試劑均購自中國寶生物工程有限公司。PCR 引物由中國上海英俊生物技術(shù)有限公司合成。NC 膜購自美國Millipore 公司。鼠抗GRK4 抗體購自德國Abnova 公司。HRP－偶聯(lián)的羊抗鼠抗體和HRP－偶聯(lián)的GAPDH 單克隆抗體分別購自美國Santa Cruz 公司和中國康成生物公司。BP－98A 智能無創(chuàng)血壓計(jì)購自日本SoftronTM公司。

1.2 方法

1.2.1 GRK4γwt/R65L/A142V/A486V表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因

以pCMV6－XL－h(huán)－GRK4 質(zhì)粒(OriGene，美國，Clone ID NM_001004056.1)為模板，用PCR 法擴(kuò)增人GRK4 全長cDNA，以此為模板，以突變試劑盒標(biāo)準(zhǔn)操作程序分別將65 位精氨酸(R)突變?yōu)榱涟彼?L)、142 位丙氨酸(A)突變?yōu)槔i氨酸(V)和486 位丙氨酸(A)突變?yōu)槔i氨酸(V)，即獲得突變體GRK4γR65L、GRK4γA142V和GRK4γA486V，經(jīng)測序并比對正確后，PCR 擴(kuò)增獲得帶有Nhe I 和Xba I 酶切位點(diǎn)的完整人源 GRK4γ 野生型、GRK4γR65L、GRK4γA142V和GRK4γA486V基因，將擴(kuò)增片段插入pMD18T 載體，經(jīng)測序并比對正確后，以Nhe I 和Xba I 酶切回收 GRK4γ 野生型、GRK4γR65L、GRK4γA142V和GRK4γA486V片段，并分別克隆入雞β－肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子下游構(gòu)建全身表達(dá)人GRK4γ 野生型、GRK4γR65L、GRK4γA142V和GRK4γA486V表達(dá)載體。提取并酶切鑒定質(zhì)粒正確后，再用Pvu I 將其線性化，Sephedex G50 柱純化DNA 片段，獲得雞β－肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)的人 GRK4γ 野生型、GRK4γR65L、GRK4γA142V和GRK4γA486V基因的轉(zhuǎn)基因片段，注射前將轉(zhuǎn)基因片段濃度調(diào)整至5 ng/μL，用顯微注射法將線性化的轉(zhuǎn)基因載體注射到C57BL/6J 小鼠的受精卵中，用ICR 小鼠作假孕受體，制備轉(zhuǎn)基因小鼠。

1.2.2 PCR 鑒定GRK4γwt/R65L/A142V/A486V轉(zhuǎn)基因小鼠的基因型

轉(zhuǎn)基因小鼠在出生9～14 d 用剪趾法標(biāo)記，收集剪下的組織，用堿裂解法提取基因組DNA，用PCR 法對轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行基因型檢測。PCR 上游引物為:5′－GATGAGGACCGAAGTGATTGT，下游引物為:5′－TTGCCCAGGTTGTAAATGTG。PCR 反應(yīng)體系20 μL。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，59℃退火30 s，72℃延伸30 s，重復(fù)變性到延伸29 次，完成30 個(gè)循環(huán)。目的基因片段為623 bp。

1.2.3 Western Blot 鑒定GRK4γwt/R65L/A142V/A486V蛋白的表達(dá)

提取首建鼠的仔代陽性轉(zhuǎn)基因小鼠和同窩轉(zhuǎn)基因陰性(non－transgenic，NTG)小鼠心臟、腎臟和腎上腺組織總蛋白，進(jìn)行SDS－PAGE 凝膠電泳，蛋白轉(zhuǎn)移至NC 膜上，置于5% 脫脂奶粉中封閉，鼠抗GRK4 抗體檢測鼠源GRK4 和轉(zhuǎn)入的人源GRK4 蛋白的表達(dá)水平，HRP－偶聯(lián)的羊抗鼠抗體結(jié)合一抗，HRP－偶聯(lián)的GAPDH 單克隆抗體作為內(nèi)參。

1.2.4 無創(chuàng)血壓計(jì)測量GRK4γwt/R65L/A142V/A486V轉(zhuǎn)基因小鼠血壓

將小鼠提前半小時(shí)放入血壓測量實(shí)驗(yàn)室，讓小鼠適應(yīng)測試環(huán)境。按智能無創(chuàng)血壓計(jì)說明書和Steven E 報(bào)道的方法進(jìn)行小鼠尾部血壓測量［15］。

1.2.5 高鹽飼料喂養(yǎng)GRK4γA486V轉(zhuǎn)基因小鼠

于2 月齡給予NTG 小鼠和GRK4γA486V轉(zhuǎn)基因高鹽飼料(氯化鈉含量為4%，，連續(xù)喂養(yǎng)4 周后用智能無創(chuàng)血壓計(jì)測量血壓并恢復(fù)正常飼料(氯化鈉含量為0.6%)喂養(yǎng)。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 GRK4γwt/R65L/A142V/A486V轉(zhuǎn)基因小鼠的建立

測序結(jié)果表明PCR 法克隆的片段同已報(bào)道人組織GRK4 序列完全一致(GeneBank:NC_000004)，將人 GRK4γ 野生型、GRK4γR65L、GRK4γA142V和GRK4γA486V基因分別插入雞β－肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子下游，構(gòu)建得到人 GRK4γ 野生型、GRK4γR65L、GRK4γA142V和GRK4γA486V轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體(圖1A)并用顯微注射法制備轉(zhuǎn)基因小鼠。提取小鼠基因組DNA，用PCR 法擴(kuò)增623 bp 的目的片段，鑒定小鼠基因型(圖2B)。提取心臟、腎臟和腎上腺組織總蛋白，用GRK4 抗體進(jìn)行Western Blot 分析，確定轉(zhuǎn)基因小鼠GRK4 的高表達(dá)(圖1C)。通過比較NTG和轉(zhuǎn)基因小鼠中GRK4 表達(dá)水平，篩選到在心臟、腎臟和腎上腺均高表達(dá)GRK4 基因的轉(zhuǎn)基因小鼠品系。

2.2 正常飲食 GRK4γ 野生型、GRK4γR65L、GRK4γA142V和GRK4γA486V 轉(zhuǎn)基因小鼠血壓動(dòng)態(tài)對比分析

NTG 和轉(zhuǎn)基因陽性小鼠于2、4 和8 月齡進(jìn)行血壓動(dòng)態(tài)分析。結(jié)果顯示，NTG 和轉(zhuǎn)基因陽性小鼠平均動(dòng)脈血壓(mean arterial pressure，MBP)［平均動(dòng)脈血壓 = 舒張壓 + 1/3(收縮壓﹣舒張壓)］均隨著年齡的增長而增加。與NTG 小鼠相比，GRK4γ野生型和 GRK4γR65L轉(zhuǎn)基因小鼠血壓正常;GRK4γA142V轉(zhuǎn)基因小鼠在8 月齡時(shí)血壓顯著升高(P=0.009);而GRK4γA486V轉(zhuǎn)基因小鼠在正常的鈉鹽攝入情況下并未出現(xiàn)高血壓表型(圖2)。說明，外源性轉(zhuǎn)入人源 GRK4γ 野生型、GRK4γR65L和GRK4γA486V突變不會(huì)影響正常鈉鹽攝入情況下血壓水平，而GRK4γA142V突變即使在正常鈉鹽攝入情況下仍會(huì)引起血壓升高。

2.3 高鹽飲食GRK4γA486V轉(zhuǎn)基因小鼠血壓動(dòng)態(tài)對比分析

于2 月齡時(shí)將NTG 和GRK4γA486V轉(zhuǎn)基因小鼠隨機(jī)分成四組，即NTG 正常飲食組(n = 8)、GRK4γA486V正常飲食組(n =5)、NTG 高鹽飲食組(n=6)和GRK4γA486V高鹽飲食組(n =6)。正常膳食飲食組飼料中氯化鈉含量為0.6%，高鹽飲食組飼料中氯化鈉含量為4%，連續(xù)喂養(yǎng)4 周后恢復(fù)正常飲食，并對各組小鼠進(jìn)行血壓動(dòng)態(tài)分析。結(jié)果顯示，經(jīng)過高鹽飲食刺激，與正常飲食組NTG 小鼠相比，高鹽飲食組NTG 小鼠MBP 雖有所升高但差異無顯著性;而高鹽飲食組GRK4γA486V轉(zhuǎn)基因小鼠較正常飲食組GRK4γA486V轉(zhuǎn)基因小鼠MBP 顯著升高(P =0.0007)，且MBP 變化值為7.53 mmHg(圖3)。臨床上，將因鈉鹽攝入量增多而導(dǎo)致的MBP 升高值≥7 mmHg 的高血壓定義為鹽敏感性高血壓［16］。由此可知，GRK4γA486V突變誘導(dǎo)高血壓屬于鹽敏感性高血壓。

圖1 GRK4γ 野生型基因和三種GRK4γ 基因突變轉(zhuǎn)基因小鼠的建立Note:1.Blank control;2.negative control;3.positive control;5，8，11，13:positive tranggenic Mice;4，6，7，9，10，12:Negative transgenic mice.A.Establishment of GRK4γ wild－type gene and three GRK4γ variant transgenic vector;B.Genotyping GRK4γ wild－type gene and three GRK4γ variant transgenic mice by PCR;C.Expression level of target gene in the heart，kidney and adrenal gland by Western blot.Fig.1 Establishment of GRK4γ wild－type gene and three GRK4γ variant transgenic mice

圖2 正常飲食GRK4γ 野生型基因和三種GRK4γ 基因突變的轉(zhuǎn)基因小鼠血壓動(dòng)態(tài)對比分析(Note:* P＜0.01;＊＊P＜0.01)Fig.2 Contrastive analysis of dynamic changes of blood pressure of GRK4γ wildtype gene and three GRK4γ variant transgenic mice taking normal diet

圖3 高鹽飲食GRK4γA486V轉(zhuǎn)基因小鼠血壓動(dòng)態(tài)對比分析Fig.3 Contrastive analysis of dynamic changes of blood pressure of GRK4γA486V transgenic mice taking in high－salt diet

3 討論

多巴胺能和腎素－血管緊張素系統(tǒng)是兩個(gè)最主要的血壓調(diào)控途徑，二者與細(xì)胞間第二信使系統(tǒng)協(xié)同調(diào)節(jié)體內(nèi)水鈉平衡，GRK4 則在多巴胺介導(dǎo)的尿鈉排泄中發(fā)揮重要的作用。研究表明，GRK4γ 野生型可以促進(jìn)細(xì)胞間的D1R 募集至細(xì)胞膜，與第二信使偶聯(lián)，增加鈉運(yùn)輸［17］;而GRK4γ 突變體卻可通過使D1R 磷酸化及內(nèi)在化，阻止其再循環(huán)至細(xì)胞膜，并引起D1R 與第二信使解偶聯(lián)，鈉轉(zhuǎn)運(yùn)減少，鈉鉀離子ATP 酶活性降低，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增高和血管平滑肌活性增高等一系列功能異常，最終導(dǎo)致高血壓的發(fā)生。再者，GRK4γ 突變體還可通過調(diào)控其他基因的表達(dá)，如增加AT1R 的表達(dá)，增強(qiáng)抗尿鈉排泄效應(yīng)，刺激血壓升高［18］。Felder 等［19］發(fā)現(xiàn)，抑制腎GRK4 的表達(dá)可恢復(fù)高血壓患者腎近曲小管D1R功能并改善自發(fā)性高血壓大鼠的血壓水平。但目前對GRK4 的表達(dá)調(diào)控所知甚少，僅Gildea 等［20］在近期發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子c－Myc 可與GRK4 啟動(dòng)子結(jié)合，正調(diào)控人腎臟近曲小管細(xì)胞中GRK4 蛋白的表達(dá)。c－Myc 的抑制劑10074－G5 可完全抑制由磷酸化c－Myc誘導(dǎo)的GRK4 表達(dá)增高，說明GRK4 是轉(zhuǎn)錄因子c－Myc 的下游分子。此研究還發(fā)現(xiàn)，腎臟近曲小管細(xì)胞自分泌的血管緊張素Ⅱ也可刺激磷酸化c－Myc 和GRK4 的表達(dá)，若給予血管緊張素ⅡAT1R 的抑制劑洛沙坦不僅可抑制c－Myc 活性及GRK4 的表達(dá)，還能恢復(fù)D1R 與第二信使的偶聯(lián)，改善血壓水平。

本文建立了人GRK4γ 野生型、GRK4γR65L、GRK4γA142V和GRK4γA486V基因轉(zhuǎn)基因小鼠，并對其進(jìn)行血壓動(dòng)態(tài)對比分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與NTG 小鼠相比，GRK4γ 野生型和GRK4γR65L突變轉(zhuǎn)基因小鼠血壓正常;GRK4γA142V突變轉(zhuǎn)基因小鼠在正常的鈉鹽攝入情況下即可發(fā)生高血壓，而GRK4γA486V突變轉(zhuǎn)基因小鼠只有在增加鈉鹽攝入情況下才發(fā)生高血壓。Felder［19］和Wang 等［21］也得出類似的結(jié)果，說明GRK4γ 的不同突變會(huì)引起不同類型的高血壓。

GRK4γ 基因的突變與高血壓的關(guān)系對臨床上防治高血壓具有重要的指導(dǎo)意義，已有報(bào)道，非洲裔美國高血壓患者若其帶有GRK4γR65L/A142V突變，則對β－腎上腺素受體阻滯劑不敏感［22］;而血管緊張素受體阻滯劑可明顯降低帶有GRK4γA142V突變的日本高血壓患者的血壓水平［23］。

綜上所述，GRK4，尤其是人GRK4γ 亞型，在調(diào)節(jié)D1R 生物學(xué)功能中發(fā)揮重要作用，與高血壓密切相關(guān)。人GRK4 突變體不僅可以預(yù)測高血壓的類型(如，自發(fā)性高血壓、鹽敏感性高血壓)，還可預(yù)期高血壓患者對抗高血壓藥物的反應(yīng)。本文建立GRK4γA142V轉(zhuǎn)基因小鼠可作為自發(fā)性高血壓動(dòng)物模型，GRK4γA486V轉(zhuǎn)基因小鼠可作為鹽敏感性高血壓動(dòng)物模型，為研究GRK4γ 突變與高血壓發(fā)病機(jī)制的關(guān)系提供了有價(jià)值的疾病動(dòng)物模型。

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