王學涵 王福剛 田 剛

DKK1對乳腺癌細胞遷移侵襲能力影響的研究*

王學涵①王福剛②田 剛③

目的：探討Dikkopf 1（DKK1）對乳腺癌細胞遷移侵襲能力的影響。方法：采用免疫組織化學方法檢測DKK1在乳腺癌組織中的表達，并通過免疫熒光對DKK1在細胞中的定位進行分析；DKK1過表達的真核表達載體轉(zhuǎn)染乳腺癌細胞MDA231，應用Western blot檢測轉(zhuǎn)染后乳腺癌細胞MDA231中DKK1蛋白表達水平。劃痕實驗檢測轉(zhuǎn)染后MDA231細胞的遷移能力，Transwell實驗檢測MDA231細胞侵襲能力的改變。結(jié)果：免疫組織化學檢測到乳腺癌組織原發(fā)病灶及轉(zhuǎn)移病灶DKK1表達明顯高于對應的癌旁組織（P＜0.05）。DKK1表達的陽性率在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中明顯比無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中低。免疫熒光結(jié)果顯示DKK1主要呈細顆粒狀散在分布于細胞質(zhì)中。Western blot檢測表明DKK1過表達明顯。過表達DKK1的MDA231細胞遷移和侵襲能力明顯比陰性對照組和空白組低。結(jié)論：DKK1的表達與乳腺癌細胞遷移和侵襲能力呈負相關(guān)。

乳腺癌 DKK1遷移 侵襲

乳腺癌是嚴重影響婦女健康的重大疾病，其發(fā)病率和死亡率已升至婦女惡性腫瘤的第2位。乳腺癌轉(zhuǎn)移是影響患者預后的主要因素，如何抑制癌細胞的擴散已成為各國學者研究的熱點。Dikkopf家族包括4個成員，其中Dikkopf1（DKK1）是一種分泌性糖蛋白，且能抑制Wnt/β-catenin信號通路的轉(zhuǎn)導［1］，其在腫瘤進程中的作用已引起廣泛關(guān)注，DKK1在肝癌、乳腺癌、膠質(zhì)瘤和骨髓瘤中有不同的表達，與腫瘤致病機制的關(guān)系還有待進一步探討［2-3］。本研究就其在乳腺癌遷移侵襲中的作用進行一些有意義的探討，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織標本、細胞系和質(zhì)粒 選取新疆醫(yī)科大學第五附屬醫(yī)院2006年3月至2010年4月乳腺癌手術(shù)病例31例，取材包括癌組織，癌旁組織及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)。乳腺癌細胞株MDA231由上海生物細胞所提供。pCMV Tag-2b-DKK1和pCMV-Tag-2b由本研究構(gòu)建。

1.1.2 主要試劑 RPMI 1640、新生小牛血清（NBS）及Lipofectmine2000購自Gibco公司；DKK1兔抗人單克隆抗體及兔抗人β-actin多克隆抗體購自Invitrogen公司；Boyden小室、Transwell小室均購自美國Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 乳腺癌MDA231細胞使用含10% NBS、100 μg/mL鏈霉素、100 U/mL青霉素的RPMI 1640培養(yǎng)。細胞進入對數(shù)生長期后，使用PBS清洗2次，0.25%胰酶消化，接種到6孔板內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)備用［4］。1.2.2 免疫組織化學和免疫熒光檢測DKK1表達1）免疫組織化學操作按試劑盒說明。用已知陽性切片（乳腺癌）為陽性對照，陰性對照片采用PBS代替一抗。染色結(jié)果由2名病理科醫(yī)生采用雙盲原則評定。淺黃至棕黃色為陽性細胞［5］。2）免疫熒光操作按試劑盒說明。含有3%BSA的PBS一抗（1：200稀釋），室溫下孵育60 min后使用PBS洗5 min×3次，羅丹明標記的二抗在室溫下反應60 min進行染色，再使用PBS洗5 min×3次，用DAPI對細胞核進行染色，最后在激光共聚焦顯微鏡下進行觀察［6］。

1.2.3 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染pCMV Tag-2b-DKK1（實驗組）、pCMV-Tag-2b（陰性對照組）和不轉(zhuǎn)染載體（空白對照組）后，置37°C，5%CO2孵化箱內(nèi)培養(yǎng)6 h后，換成普通的RPMI 1640+10%FBS培養(yǎng)液；細胞轉(zhuǎn)染24 h后傳代；細胞貼壁后加入Hygromycin B篩選［7］。

1.2.4 Western blot檢測DKK1的表達 乳腺癌細胞培養(yǎng)進入對數(shù)生長期，向反應板加入RIPA裂解細胞液（300 μL/孔，其中PMSF濃度為0.1%），冰上裂解30 min后，將其收集在1.5 mL EP管中，4℃下15 000 r/min離心15 min，將上清液轉(zhuǎn)移至另一滅菌EP管中，BCA法測定蛋白濃度。每個樣品取50 μg蛋白進行檢測，用10%SDS-PAGE膠進行電泳，蛋白電轉(zhuǎn)到PVDF膜上；5%脫脂奶粉4℃過夜封閉，用DKK1的兔抗人單克隆一抗（1：1 000）室溫下孵育2 h，再用過氧化物酶標記的羊抗兔二抗（1：5 000稀釋）室溫下孵育30 min，以β-actin為內(nèi)參，采用Bandscan 5.0軟件分析蛋白條帶總灰度值，檢測表達差異。

1.2.5 細胞遷移能力實驗 6孔培養(yǎng)板接種5×105/孔細胞孵育過夜，待底層長滿細胞后，每隔0.5～1 cm用無菌移液槍頭劃均勻直線一道。用PBS沖洗去除劃落細胞，加入無血清培養(yǎng)基。放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中分別于0和24 h觀察劃痕處細胞愈合距離，最后在激光共聚焦顯微鏡下拍照［8］。

1.2.6 細胞侵襲能力實驗 冰上將Matrigel膠與無血清的DMEM培養(yǎng)基以1：5比例稀釋，然后在12孔Transwell小室中加入120 uL/孔，然后置于37℃孵育1 h使基質(zhì)膠凝固。消化重懸細胞并調(diào)整細胞濃度為5×105/mL，將400 uL細胞懸液加入Transwell小室，下室中加入800 uL含10%血清的培養(yǎng)基，37℃孵育48 h后，小心去掉Matrigel膠，擦去未穿過膜的細胞，4% PFA固定10 min，采用0.005%結(jié)晶紫染色40 min，顯微鏡下觀察透過膜的細胞數(shù)（×200），隨機取5個視野計數(shù)取平均值［9］。

2 結(jié)果

2.1 DKK1在乳腺癌中的表達和分布

通過免疫組織化學分析了臨床手術(shù)切除的乳腺癌標本中DKK1表達情況，高倍鏡下觀察到胞核中顯像棕黃色顆粒為陽性。根據(jù)著色深淺分4種強度：深棕色為強陽性（+++），棕黃色為陽性（++），淺黃色為弱陽性（+），無著色為陰性（-）。癌旁組織中陽性例數(shù)4例，癌組織中陽性例數(shù)27例，無淋巴轉(zhuǎn)移組織中陽性例數(shù)20例。乳腺癌原發(fā)病灶及轉(zhuǎn)移病灶DKK1表達明顯高于對應的癌旁組織（P＜0.05）。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中DKK1表達的陽性率明顯比無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中的陽性率低（χ2=28.36，P＜0.01）。可見DKK1的表達與乳腺癌是否轉(zhuǎn)移，特別是淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。免疫熒光檢測乳腺癌MDA231細胞中DKK1的表達，結(jié)果顯示DKK1主要分布在細胞質(zhì)中，呈細顆粒狀散在分布（圖1）。

2.2 Western blot檢測MDA231細胞的DKK1過表達水平

MDA231細胞轉(zhuǎn)染pCMV Tag-2b-DKK1（實驗組）、pCMV-Tag-2b（陰性對照組）和不轉(zhuǎn)染載體（空白對照組）后，結(jié)果表明DKK1在實驗組表達明顯增高。

圖1 DKK1在乳腺癌細胞中的分布Figure 1 Distribution of DKK1 in breast cells

2.3 過表達DKK1的MDA231細胞遷移能力變化

24 h后，陰性對照組和空白對照組細胞的劃痕幾乎完全愈合，而實驗組的細胞愈合明顯落后，即低表達DKK1的MDA231細胞遷移能力顯著下降。

2.4 過表達DKK1的MDA231細胞侵襲能力變化

通過Transwell小室檢測MDA231細胞轉(zhuǎn)染低表達DKK1的重組質(zhì)粒后細胞侵襲能力的改變。結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染pCMV-Tag-2b-DKK1的乳腺癌細胞通過Transwell小室基底膜的細胞數(shù)（40個/高倍視野）明顯低于轉(zhuǎn)染pCMV-Tag-2b組（200個/高倍視野）和空白對照組（209個/高倍視野）細胞數(shù)，表明過表達DKK1的MDA231細胞侵襲能力受到抑制。

3 討論

Wnt/β-catenin是Wnt經(jīng)典信號通路，通路活化過程是胞外Wnt蛋白與相應的受體結(jié)合抑制了糖原合成激酶降解復合物形成，從而抑制β-catenin磷酸化，繼而激活其下游靶分子而發(fā)揮一系列功能作用［10-11］。DKK1是一種分泌性糖蛋白，能夠與細胞膜上的Wnt受體LRP5和DKK1共受體Kremen1結(jié)合，形成內(nèi)吞小體，從而阻斷Wnt信號通路［12-13］。可見DKK1發(fā)揮生物學效應與抑制Wnt通路有關(guān)。腫瘤細胞的遷移侵襲能力制約是其殺滅的關(guān)鍵。國內(nèi)有學者證實在高遷移的乳腺癌細胞DKK1的表達降低，低遷移的乳腺癌細胞DKK1表達有升高趨勢［14］。國外有文獻報道DKK1表達缺失具有促進腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的作用［15］。本研究的結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達DKK1的乳腺癌細胞“傷口愈合”能力明顯降低，且乳腺癌細胞的侵襲能力也明顯受到抑制。本研究所得結(jié)論與國內(nèi)外學者報道相符。

本研究通過免疫組織化學方法對乳腺癌組織患者的標本進行DKK1表達觀察發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織DKK1表達高于相應的癌旁組織，且有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌組織DKK1的表達明顯低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌組織。這一點也充分表明DKK1的表達與乳腺癌遠端轉(zhuǎn)移能力呈負相關(guān)?？梢奃KK1作為Wnt通路的抑制因子，可通過抑制β-catenin的表達而遏制腫瘤細胞的遷移和侵襲。高表達DKK1可促進乳腺癌細胞的靜息程度。免疫熒光檢測DKK1在乳腺癌細胞中主要分布于細胞質(zhì)，呈細顆粒狀散在分布，符合DKK1是分泌性蛋白的稱謂，其分布位置和特點為深層次研究DKK1在腫瘤侵襲中的作用提供了重要的依據(jù)。

總之，本研究為進一步揭示W(wǎng)nt/β-catenin通路與乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系奠定了一定的實驗參考。

1 Yu B,Yang X,Xu Y,et al.Elevated expression of DKK1 is associated with cytoplasmic/nuclear beta-catenin accumulation and poor prognosis in hepatocellular carcinomas[J].J Hepatol,2009,50(5): 948-957.

2 Hirata H,Hinoda Y,Nakajima K,et al.Wnt antagonist DKK1 acts as a tumor suppressor gene that induces apoptosis and inhibits proliferation in human renal cell carcinoma[J].Int J Cancer,2010,55 (9):1012-1015.

3 Takahashi N,Fukushima T,Yorita K,et al.Dickkopf-1 is overexpressed in human pancreatic ductal adenocarcinoma cells and is involved in invasive growth[J].Int J Cancer,2010,126(7):1611-1620.

4 Tian G,Wang X,Zhang F,et al.Down-regulation of cPLA2γ expression inhibits EGF-induced chemotaxis of human breast cancer cells through Akt pathway[J].BBRC,2011,409(3):506-512.

5 陽澤斌,田 剛,孫 楊,等.磷脂酶C-γ1(PLC-γ1)在乳腺癌組織中表達及其對細胞運動作用的研究[J].現(xiàn)代檢驗醫(yī)學雜志,2011,26(3): 90-92.

6 李書軍,和宇崢,呂寶雷,等.DKK1在食管癌組織中的表達及其生物學功能[J].世界華人消化雜志,2011,19(20):2116-2122.

7 李書軍,和宇崢,閆紅紅,等.siRNA沉默artermin蛋白對食管癌TE11細胞侵襲能力的影響[J].中國腫瘤臨床,2010,37(24):1432-1436.

8 王洪玉,郭立莎,吳 敏,等.EHD2干擾影響永生化乳腺上皮細胞的增殖和遷移[J].中國腫瘤臨床,2011,38(11):601-604.

9 田 剛,王學涵,應國光,等.EHD2下調(diào)促進乳腺上皮細胞轉(zhuǎn)化的研究[J].現(xiàn)代檢驗醫(yī)學雜志,2012,27(1):88-90.

10姜 博,廉永云.DKK1蛋白的研究現(xiàn)狀進展及臨床意義[J].醫(yī)學與哲學,2012,33(1):101-103.

11 Mao B,Wu W,Davidson G,et al.Kremen proteins are Dickkopf receptors that regulate Wnt/beta-catenin signalling[J].Nature,2002, 417(6889):664-667.

12 Makale M.Cellular mechanobiology and cancer metastasis[J].Birth Defects Res C Embryo Today,2007,81(4):329-343.

13 Heider U,Kaiser M,Mieth M,et al.Serum concentrations of DKK-1 decrease in patients with multiple myeloma responding to anti-myeloma treatment[J].Eur J Haematol,2009,82(1):31-38.

14周曉雷,張曉東,業(yè)麗紅.DKK1通過上調(diào)nm23表達抑制乳腺癌細胞遷移[J].中國生物化學與分子生物學報,2010,26(2):164-169.

15 Yao X,Jiang H,Zhang C,et al.Dickkopf-1 autoantibody is a novel serological biomarker for non-small cll lung cancer[J].Biomarkers,2010,15(2):128-134.

（2013-07-15收稿）

（2013-09-03修回）（本文編輯：周曉穎）

Effects of DKK1 on breast cancer cell migration and invasion capability

Xuehan WANG1,Fugang WANG2,Gang TIAN3

Gang TIAN;E-mail:tiangang_chn@126.com
1Department of Clinical Laboratory,FifthAffiliated Hospital of Xinjiang Medical University,Urumqi 830011,China
2Department of Clinical Laboratory,People's Hospital of Kelamayi,Kelamayi 834000,China
3Department of Clinical Laboratory,Tianjin Gong'an Hospital,Tianjin 300040,China

Objective:To analyze the DKK1 expression in breast cancer cell line MDA-MB-231 and examine its effect on the migration and invasion of the cell line.Method:DKK1 expression in the breast cancer tissues was detected immunohistochemically,and DKK1 distribution in the breast cancer cells was observed using immunofluorescence.Western blot was used to investigate DKK1 expression in breast cancer tissues and their matched normal breast tissues.A eukaryotic expression vector of DKK1 was constructed and transfected into MDA231 cell line.The migration and invasion ability of the cells were observed through scratch assay and Boyden chamber,respectively.Results:Immunohistochemical staining showed that DKK1 in the transfected lymph node or non-lymph node was highly expressed in the breast cancer tissues(P＜0.05).The positive DKK1 expression in lymph node metastasis was less significant than those in non-lymph node transfected cells.Immunofluorescence localization results showed a remarkable bright red granular fluorescence in the cytoplasm of the MDA231 cell line.Western blot analysis showed that the DKK1 protein expression in carcinoma tissues were obviously higher than that in matched normal breast tissues.The migration and invasion ability of DKK1-overexpressed MDA231 cell was lower than those of MDA231 cell transfected with pCMV-Tag-2b empty vector.Conclusion:Negative correlation was found between DKK1 expression and the migration and invasion ability in breast cancer cells.

breast cancer,DKK1,migration,invasion

10.3969/j.issn.1000-8179.20131491

①新疆醫(yī)科大學第五附屬醫(yī)院檢驗科（烏魯木齊市830011）；②新疆克拉瑪依市人民醫(yī)院檢驗科；③天津市公安醫(yī)院檢驗科

*本文課題受天津市濱海新區(qū)衛(wèi)生局科研基金項目（編號：2100BHKL004，2100BHKY023）資助

田剛 TIANGANG_CHN@126.COM

This work was supported by the Scientific Research Funds of Tianjin Binhai Prefectural Municipal Bureau of Health(Nos. 2100BHKL004 and 2100BHKY023)