張 穎 劉 瑩 符愛珍 李元軍 范炳娟 羅 新

近年來，腹腔鏡手術(shù)以其創(chuàng)傷小、恢復(fù)速度快等優(yōu)點(diǎn)應(yīng)用于臨床手術(shù)中，多用于婦科良性疾病中，而其對于婦科惡性腫瘤的應(yīng)用一直存在爭議，爭議的焦點(diǎn)在于CO2建立的氣腹環(huán)境對惡性腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移是否存在影響。CXCL12是重要的趨化因子，與其特異性受體CXCR4相互作用而構(gòu)成的一個與細(xì)胞間信息傳遞、細(xì)胞遷移有密切關(guān)系的偶聯(lián)分子對，并稱為CXCL12/CXCR4生物學(xué)軸，后者不僅參與白細(xì)胞浸潤、細(xì)胞遷移和器官發(fā)育等一系列重要的生理過程，在惡性腫瘤的局部侵襲和器官特異性轉(zhuǎn)移中具有重要作用［1-3］。本實(shí)驗(yàn)擬建立人卵巢癌裸鼠腹腔種植瘤模型，通過單純麻醉、開腹0.5 h組、CO2氣腹0.5 h、CO2氣腹1 h處理后，監(jiān)測腹腔種植瘤趨化因子CXCL12及受體CXCR4的表達(dá)。探討相同手術(shù)時間和不同手術(shù)方式，相同手術(shù)方式和不同手術(shù)時間對卵巢癌的影響，并探討CO2氣腹對卵巢癌侵襲轉(zhuǎn)移的影響，以期為腹腔鏡手術(shù)的安全性提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 人卵巢漿液性乳頭狀腺癌SKOV3細(xì)胞購于中科院上海細(xì)胞資源中心。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動物 BALB/c裸小鼠購自廣東醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心，鼠齡5～6周，全部雌性，體質(zhì)量為18～22 g，共40只，在廣東醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心飼養(yǎng)，室溫恒定，集中通風(fēng)，以無菌顆粒食物及無菌水飼養(yǎng)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑、儀器 RPMI 1640培養(yǎng)基、胰酶均為美國Gibco公司產(chǎn)品；小牛血清購于杭州四季青生物工程公司；總蛋白提取試劑盒、ECL顯色液、總RNA提取試劑盒及PCR相關(guān)試劑購于江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司；二氧化碳孵箱為德國Binder公司產(chǎn)品；倒置顯微鏡購自德國Leica公司；PCR儀購于美國BIo-Rad公司。所用引物序列均由上海生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3用含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2的飽和濕度條件下培養(yǎng)。細(xì)胞2～3d換液1次，待細(xì)胞平鋪培養(yǎng)瓶底80%時，傳代1次，經(jīng)傳代10次，細(xì)胞生長穩(wěn)定后，取細(xì)胞用于動物實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 動物實(shí)驗(yàn) 取生長對數(shù)期SKOV3細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，裸鼠腹腔內(nèi)注射1×107/只細(xì)胞，生長8 w成瘤后將40只荷瘤裸鼠隨機(jī)分為4組，每組10只，并分別進(jìn)行處理。1）單純麻醉組：麻醉采用10%水合氯醛，以于左下腹0.3 mL/100 g腹腔注射，麻醉成功持續(xù)30 min。2）開腹組：水合氯醛麻醉成功后，取下腹正中約1 cm長切口，暴露腸管，將切口敞開后在空氣中暴露30 min，7.0號絲線全層關(guān)腹。3）CO2氣腹0.5 h組：水合氯醛麻醉成功后，置入皮試針頭，制造CO2氣腹，流量為0.5 L/min，時間約0.5 h。4）CO2氣腹1 h組：水合氯醛麻醉成功后，置入皮試針頭，制造CO2氣腹，流量為0.5 L/min，時間約1 h。以上設(shè)計(jì)分別模擬開腹及腹腔鏡手術(shù)的操作。處理結(jié)束后處死裸鼠，剖腹觀察裸鼠腹腔內(nèi)腫瘤數(shù)目，以直徑＞1 mm納入計(jì)數(shù)，依次探查膈肌表面、肝、脾、大小網(wǎng)膜、腸管、腎、膀胱及腹膜后淋巴結(jié)的腫瘤形成及生長情況，并取瘤體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 RT-PCR實(shí)驗(yàn) 應(yīng)用總RNA提取試劑提取各瘤體中的總RNA，提取過程嚴(yán)格按照試劑說明書操作。引物序列見表1。循環(huán)條件為：PCR反應(yīng)產(chǎn)物的大小分別為 117 bp（CXCR4）、98 bp（CXCL12）和141 bp（GAPDH-F），PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色。使用紫外光凝膠照像，經(jīng)Image J軟件進(jìn)行灰度測定，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。將CXCR4和CXCL12的灰度值與GAPDH-F灰度值的比值進(jìn)行分析。

表1 RT-PCR引物及其序列Table1 Primer and its RT-PCR sequences

1.2.4 Western blot實(shí)驗(yàn) 將各組瘤體研磨成均漿，應(yīng)用總蛋白提取試劑盒提取瘤體中的總蛋白，提取過程嚴(yán)格按照說明書操作。將所獲蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，上樣量40 μg/孔，10%分離膠濃度，恒定電流10 mA。電泳后進(jìn)行NC膜轉(zhuǎn)移，在4℃試劑環(huán)境下進(jìn)行100 V電轉(zhuǎn)4 h。將NC膜浸泡于3%BSA/TBS溶液中，4℃封閉過夜。洗膜后加入兔抗小鼠β-actin、CXCR4和CXCL12單克隆抗體（分別為1:2 000、1:200、1:500稀釋），室溫孵育2 h。再次洗膜后加入過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體，室溫孵育0.5 h。洗膜后加入ECL顯色液顯色，至蛋白條帶清晰可見時，攝像并保存結(jié)果，應(yīng)用Quantity one分析軟件測定各蛋白帶條的吸光值，并以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算兩指標(biāo)相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)所獲數(shù)據(jù)采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的單因素方差分析（One-Way ANOVA）檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動物實(shí)驗(yàn)

4組裸鼠于接種8 w后明顯成瘤，腹腔種植瘤模型成功建立。動物模型制作過程中，所有裸鼠精神狀態(tài)均良好，進(jìn)食正常，無消化系統(tǒng)等異常情況發(fā)生。經(jīng)處理后解剖觀察腫瘤生長情況，CO2氣腹1 h組腫瘤數(shù)目明顯多于其余2組，且轉(zhuǎn)移范圍明顯較其余2組廣泛（圖1，表2）。

圖1 人卵巢癌SKOV3細(xì)胞裸鼠移植瘤經(jīng)處理后轉(zhuǎn)移情況Figure1 Metastases of SKOV3 cells in nude mice after treatment

2.2 RT-PCR結(jié)果

CO2氣腹1 h組腫瘤組織CXCL12 mRNA表達(dá)明顯高于其余3組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），CXCR4 mRNA表達(dá)在各組間無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖2、3）。

2.3 Western blot結(jié)果

CO2氣腹1 h組腫瘤組織CXCL12蛋白表達(dá)明顯高于其余3組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而CXCR4蛋白表達(dá)在各組間無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），其表達(dá)規(guī)律基本與mRNA一致（表3，圖4）。

表2 不同處理方法對各組裸鼠腫瘤轉(zhuǎn)移情況的影響 只Table2 Effects of different treatment methods on tumor metastasis in nude mice of each group

圖2 各組裸鼠經(jīng)處理后CXCL12、CXCR4mRNA的表達(dá)變化Figure2 Changes in the expression levels of CXCR4 and CXCL12 mRNAs of nude mice in each group after treatment

圖3 腫瘤提取RNA電泳圖Figure3 Electrophoresis of tumor RNA

表3 各組瘤體組織CXCL12、CXCR4蛋白相對表達(dá)量Table3 Relative expression levels of CXCR4 and CXCL12 proteins in the tumor tissues of each group

3 討論

卵巢癌是死亡率最高的婦科惡性腫瘤，目前主要治療方法為手術(shù)，而腹腔鏡手術(shù)是飛速發(fā)展的微創(chuàng)手術(shù)方式，具有簡便、容易恢復(fù)等特點(diǎn)。隨著腹腔鏡在婦科惡性腫瘤手術(shù)中的應(yīng)用逐漸增多，隨之而來的關(guān)于腹腔鏡應(yīng)用是否會造成惡性腫瘤腹腔內(nèi)腫瘤播散，成為近年來的一個研究熱點(diǎn)。有研究證實(shí)，利用氦氣、空氣、氙氣、氧化亞氮等氣體作為腹腔鏡的介質(zhì)比較，在CO2氣體作用下更容易促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移［4］。國內(nèi)外動物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，排除CO2由壓力因素造成外CO2氣腹與氮?dú)?、氦氣、無氣腹腹腔鏡及開腹手術(shù)比較，其更易造成惡性腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲［5］。Leng等［6］研究發(fā)現(xiàn)，開腹組與CO2氣腹組對結(jié)腸癌細(xì)胞種植腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖4 各組腫瘤組織CXCL12、CXCR4表達(dá)變化Figure4 Changes in the expression levels of CXCR4 and CXCL12 in the tumor tissues of each group

有研究發(fā)現(xiàn)，不同壓力相同時間下對卵巢癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移均有影響［7］。但在臨床腹腔鏡手術(shù)的過程中，是持續(xù)相同的氣腹壓力，不同的手術(shù)時間，針對卵巢癌這種惡性腫瘤手術(shù)，通常開腹手術(shù)時間為4 h左右，腹腔鏡手術(shù)時間為5 h以上［8］，手術(shù)時間明顯較長。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在相同時間不同的手術(shù)方式作用下，氣腹組和開腹組趨化因子CXCL12及受體CXCR4表達(dá)無明顯差異，在不同時間相同手術(shù)方式中，氣腹組1 h CXCL12的表達(dá)明顯高于氣腹組0.5 h，CXCR4表達(dá)無明顯差異，這提示氣腹時間是影響腫瘤生長的一個重要因素。

根據(jù)對趨化因子及其受體在腫瘤中的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮的作用，研究發(fā)現(xiàn)人的正常卵巢癌組織中不表達(dá)趨化因子CXCL12及受體CXCR4，但在卵巢癌組織中高表達(dá)［9］。對卵巢癌高轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞株HO-8910PM的研究中發(fā)現(xiàn)，CXCL12可促進(jìn)癌細(xì)胞株增殖，在Transwell細(xì)胞侵襲與遷移實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，CXCL12可顯著提高HO-8910PM細(xì)胞的侵襲能力［10］。CXCL12可以通過激活受體CXCR4在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用，自分泌或旁分泌形式促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增長和轉(zhuǎn)移。研究發(fā)現(xiàn)，CXCL12卵巢癌的癌性腹水是由CXCL12和VEGF協(xié)同誘導(dǎo)產(chǎn)生［11-13］。CXCL12以兩種方式促進(jìn)血管的生成，一種是直接誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌血管內(nèi)皮生長因子（VEGF），以旁分泌、自分泌的方式促進(jìn)血管生成；另一種是間接的刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌MMP-2、MMP-9形成毛細(xì)血管通道，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖及遷移，利于卵巢癌癌灶的形成和轉(zhuǎn)移［14-15］。究發(fā)現(xiàn)，趨化因子CXCL12在氣腹1 h組中的高表達(dá)，這可能間接使VEGF表達(dá)增高，從而為腫瘤提供新的血管，供腫瘤組織生長。

綜上所述，本研究證實(shí)趨化因子CXCL12在氣腹1 h組中高表達(dá)，而CXCR4則無表達(dá)，因此推測卵巢癌開腹手術(shù)與腹腔鏡手術(shù)比較，相同時間能夠完成的手術(shù)，兩者對腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲無明顯的影響，但與復(fù)雜、難度大的手術(shù)比較，腹腔鏡所用的時間比開腹手術(shù)時間長，對惡性腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移影響較大。

1 Ziarek JJ,Liu Y,Smith E,et al.Fragment-based optimization of small molecule CXCL12 inhibitors for antagonizing the CXCL12/CXCR4 interaction[J].Curr Top Med Chem,2012,12(24):2727-2740.

2 Virgintino D,Errede M,Rizzi M,et al.The CXCL12/CXCR4/CXCR7 ligand-receptor system regulates neuro-glio-vascular interactions and vessel growth during human brain development[J].J Inherit Metab Dis,2013,36(3):455-466.

3 Dai X,Mao Z,Huang J,et al.The CXCL12/CXCR4 autocrine loop increases the metastatic potential of non-small cell lung cancer in vitro[J].Oncol Lett,2013,5(1):277-282.

4 Curet MJ.Port site metastasis[J].Am J Surg,2004,187(6):705-712.

5 Ramirez PT,Wolf JK,Levenback C.Laparoscopic port-sitemetastases:etiology and prevention[J].Gynecol Oncol,2003,91(1):179-189.

6 Leng J,Lang J,Jiang Y,et al.Impact of different p ressures and exposure times of a simulated carbon dioxide pneumoperitoneum environment on p roliferation and apop tosis of human ovarian cancer cell lines[J].Surg Endosc,2006,20(10):1556-1559.

7 Agostini A,Robin F,Jais JP,et al.Impact of different gases and pneumoperitoneum pressures on tumor growth during laparoscopy in a rat model[J].Surg Endosc,2002,16(3):529-532.

8 Hao T,Li M,Xiong G.Comparison of laparoscopic and laparotom ic staging of early-stage ovarian cancer[J].Chin J Min Inv Surg,2010,10(3):268-271.

9 Scotton CJ,Wilson JL,Milliken D,et al.Epithelial cancer cell Migration:a role for chemokine receptors[J]?Cancer Res,2001,61(13):4961-4965.

10 Liang J.Effects of CXCL12/CXCR-4 on proliferation and migration of high and low metastatic human ovarian cancer cells in vitro[J].Med J West China,2012,24(5):845-847.

11 Kryczek I,Lange A,Mottram P,et al.CXCL12 and vascular endothelialgrowth factor synergistically induce neoangiogenesis in human ovarian cancers[J].Cancer Res,2005,65(2):465-472.

12 Ziarek JJ,Veldkamp CT,Zhang F,et al.Heparin oligosaccharides inhibit chemokine(CXC motif)ligand 12(CXCL12)cardioprotection by binding orthogonal to the dimerization interface,promoting oligomerization,and competing with the chemokine(CXC motif)receptor 4(CXCR4)N terminus[J].J Biol Chem,2013,288(1):737-746.

13 McCaig AM,Cosimo E,Leach MT,et al.Dasatinib inhibits CXCR4 signaling in chronic lymphocytic leukaemia cells and impairs migration towards CXCL12[J].PLoS One,2012,7(11):e48929.

14 Xing B,Kong YG,Yao Y,et al.Study on the Expression Levels of CXCR4,CXCL12,CD44,and CD147 and Their Potential Correlation with Invasive Behaviors of Pituitary Adenomas[J].Biomed Environ Sci,2013,26(7):592-598.

15 Warner JA,Zwezdaryk KJ,Day B,et al.Human cytomegalovirus infection inhibits CXCL12-mediated migration and invasion of human extravillous cytotrophoblasts[J].Virol J,2012,1(9):255.