岳麗紅， 程廣東* ， 鄭 冰， 朱德全， 吳玉德， 徐 岳

(1.佳木斯大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江佳木斯154007;2.順德出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東順德528303;3.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，黑龍江哈爾濱150081)

0 引 言

藏靈菇發(fā)酵乳是用西藏靈菇(又稱西藏雪蓮)發(fā)酵牛奶而成的傳統(tǒng)民間飲品，多年來廣受百姓喜愛.近年來，隨著對(duì)西藏靈菇及其發(fā)酵乳的研究日趨深入，西藏靈菇發(fā)酵乳的保健作用也得到了研究證明，如調(diào)節(jié)菌群平衡、治療消化道疾病、抑制腫瘤、降低血脂血壓、延緩衰老等［1～3］，對(duì)于其延緩衰老作用的機(jī)制，岳麗紅等的研究結(jié)果表明其可對(duì)抗心、肝、腎組織自由基氧化損傷［4～5］.為研究其對(duì)腦組織抗氧化作用的影響，本實(shí)驗(yàn)給予D -半乳糖(D-gal)衰老小鼠灌服西藏靈菇發(fā)酵乳處理，檢測其對(duì)小鼠腦組織器官指數(shù)，腦組織中總一氧化氮合酶(TNOS)和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)活力水平及一氧化氮(NO)含量的影響，進(jìn)一步探討其對(duì)抗腦組織衰老作用的分子機(jī)理，為研究西藏靈菇發(fā)酵乳的保健作用提供科學(xué)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明種健康小鼠(80 ～90 日齡)24 只，雌雄各半，平均體重(21.78 ±0.73)g，購于佳木斯大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心.

1.2 試 劑

藏靈菇由佳木斯大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供.靈菇發(fā)酵乳制備:每天上午將藏靈菇用冷開水洗凈，按1 ℅接種量接入伊利純牛奶中，19±1℃條件下培養(yǎng)24 h，取發(fā)酵牛乳備用.

D-gal(恒信化學(xué)試劑有限公司)，考馬斯亮蘭蛋白試劑盒、NO、TNOS、iNOS 測定試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)20101206 -15).

1.3 儀 器

722PC 分光光度計(jì)(上海棱光技術(shù)有限公司)，組織勻漿機(jī)，高靈敏度pH 計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)，離心機(jī)(長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司)，電子天平等(北京賽多利斯天平有限公司，d=0.1mg).

1.4 動(dòng)物分組與給藥

將24 只雌雄小鼠分別隨機(jī)分成對(duì)照組、衰老組和靈菇發(fā)酵乳處理組，分籠飼養(yǎng)，編號(hào)標(biāo)記.飼養(yǎng)溫度18 ℃～20 ℃，相對(duì)濕度50 % ～60 %，飼喂標(biāo)準(zhǔn)飼料.每日上午8:00 進(jìn)行給藥處理:對(duì)照組腹腔注射生理鹽水0.65 ml/只，灌胃溫開水0.5 ml/只;衰老組按100 mg/kg 體重/只劑量腹腔注射D -gal，灌胃溫開水0.5 ml/只;靈菇發(fā)酵乳處理組注射同樣劑量D-gal，同時(shí)灌胃靈菇酸奶0.5 ml/只.連續(xù)處理30 d，每5d 稱體質(zhì)量并記錄.

1. 5 10%腦組織勻漿的制備

末次給藥24h 后，頸動(dòng)脈放血處死小鼠;迅速按試劑盒說明書的要求在冰板上取腦組織;濾紙吸干殘血，稱取2 g;用預(yù)冷的0.86%生理鹽水，在冰水中用組織勻漿機(jī)制備腦組織勻漿.測定腦組織蛋白質(zhì)含量，TNOS，iNOS 酶活力及NO 水平.

1.6 生化指標(biāo)的檢測

考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)含量，硝酸還原酶法檢測NO 濃度，底物分解法檢測TNOS，iNOS 活性，均按測試盒所示方法、步驟進(jìn)行.

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS11.5 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理.

2 結(jié) 果

2.1 藏靈菇發(fā)酵乳對(duì)體質(zhì)量與腦器官指數(shù)的影響

表1 顯示，與對(duì)照組相比，衰老組小鼠體質(zhì)量顯著降低(p ＜0.05)，腦指數(shù)降低，但差異不顯著(p ＞0.05);與衰老組相比，藏靈菇發(fā)酵乳組體質(zhì)量顯著增加(p ＜0.05)，腦器官指數(shù)增加，差異不顯著(p ＞0.05)(表1).

2.2 藏靈菇發(fā)酵乳對(duì)小鼠腦組織TNOS 活力，iNOS 活力和NO 的影響

表2 顯示，與對(duì)照組相比，衰老組小鼠的腦組織TNOS，iNOS 活力極顯著升高(p ＜0.01)，NO 含量極顯著增加(p ＜0.01);與衰老組對(duì)比，藏靈菇發(fā)酵乳組腦組織TNOS 活力顯著降低(p ＜0.05)，iNOS 活力極顯著降低(p ＜0.01)，NO 含量極顯著降低(p ＜0.01)(表2).

3 討 論

衰老是一種復(fù)雜的生理現(xiàn)象，包括機(jī)體內(nèi)各種生理生化綜合反應(yīng). 自由基學(xué)說是目前公認(rèn)的，并經(jīng)過理論和實(shí)驗(yàn)證實(shí)的最有說服力的衰老學(xué)說之一.自由基誘發(fā)細(xì)胞膜或細(xì)胞器膜中不飽和脂肪酸發(fā)生過氧化作用，是生物衰老的重要原因之一. 因此，如能減少自由基生成和增強(qiáng)機(jī)體抗自由基能力、有效維持二者之間的動(dòng)態(tài)平衡，勢必有延緩衰老、促進(jìn)健康的作用［6］.

表1 對(duì)小鼠體質(zhì)量、腦指數(shù)的影響(- x ±s，n = 8)

表2 對(duì)小鼠腦組織TNOS，iNOS 及NO 的影響(- x ± s，n = 8)

機(jī)體內(nèi)的NOS 主要有三種存在形式:存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元型(nNOS)，分布于內(nèi)皮細(xì)胞的內(nèi)皮型(eNOS)，存在于哺乳動(dòng)物有核細(xì)胞中的誘導(dǎo)型(iNOS). 在正常生理狀態(tài)下nNOS 和eNOS 能催化產(chǎn)生少量NO，在炎癥過程中內(nèi)毒素等會(huì)使iNOS 增加，在NOS 酶催化下持續(xù)產(chǎn)生大量NO.NO 是體內(nèi)重要的信使分子和神經(jīng)遞質(zhì)［8～10］，對(duì)機(jī)體有重要的調(diào)節(jié)意義;NO 也是一種強(qiáng)氧化劑，過量的NO 會(huì)產(chǎn)生過氧亞硝基基團(tuán)，直接對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性.研究表明，老年動(dòng)物具較高的NOS 活性，在老年大鼠小腦中eNOS 活性下降而iNOS 活性升高，進(jìn)而產(chǎn)生更多的NO.iNOS 會(huì)損傷神經(jīng)元，損傷腦組織中負(fù)責(zé)學(xué)習(xí)和記憶的區(qū)域，直接導(dǎo)致腦功能的衰退.強(qiáng)氧化劑NO 通過破壞生物大分子結(jié)構(gòu)和功能影響機(jī)體代謝，因此TNOS 和iNOS 活力及NO 含量，可間接反映腦組織細(xì)胞的損傷程度［11］.

本實(shí)驗(yàn)表明，D -gal 所致衰老模型小鼠腦組織抗氧化酶活力降低，抗氧化能力降低，強(qiáng)氧化劑NO 產(chǎn)生增多，腦組織氧化損傷嚴(yán)重. 藏靈菇發(fā)酵乳能增加致衰老模型小鼠的腦指數(shù)，但差異不顯著，說明對(duì)腦外觀形態(tài)有一定的影響;藏靈菇發(fā)酵乳能降低衰老小鼠腦組織中的TNOS 及iNOS 活性，極顯著降低NO 含量，從而減少強(qiáng)氧化劑和脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生，提高對(duì)自由基的清除能力，抑制和修復(fù)由D -半乳糖代謝產(chǎn)生的自由基和有毒物質(zhì)造成的腦組織細(xì)胞氧化的損傷，抑制衰老，提高記憶和反應(yīng)能力.

［1］ 陶應(yīng)龍，陳青，張?jiān)旅?，?食品級(jí)藏靈菇培養(yǎng)液對(duì)高脂血癥患者血脂影響［J］.中國臨床營養(yǎng)雜志，2005，10:273 -275.

［2］ 張立娜.靈菇菌乳I 號(hào)、II 號(hào)對(duì)高血壓模型大鼠的降壓作用的實(shí)驗(yàn)研究［D］.東北林業(yè)大學(xué)碩士論文，2004:13 -25.

［3］ 吳莉莉，白術(shù)杰，宗希明，等.西藏靈菇酸奶保健作用的研究［J］.黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2011，34(6):21 -22.

［4］ 岳麗紅，程廣東，王長平，等.西藏靈菇酸奶對(duì)衰老小鼠抗氧化作用的研究［J］.佳木斯大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，26(3):430 -432.

［5］ 岳麗紅，程廣東，王長平，等.西藏靈菇酸奶對(duì)人工致衰老小鼠肝腎指數(shù)的影響［J］. 中國老年學(xué)雜志，2009，29(19):2767 -2769.

［6］ 李素云，王立芹，鄭稼琳，等. 自由基與衰老的研究進(jìn)展［J］.中國老年學(xué)雜志，2007，27(10):2046 -2047.

［7］ Nathan，C，Xie，Q.W，1994. Nitric Oxide Synthases:Roles，Tolls and Controls. Cell 78，915 –918.

［8］ Laskin，D.L，Pendino，K.J，1995. Macrophages and In?ammatory Mediators in Tissue Injury. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 35:655 –677.

［9］ Kroncke，K. D.，F(xiàn)ehsel，K，Kolb -Bachofen，V，1998. Inducible Nitric Oxide Synthase in Human Diseases. Clin. Exp. Immunol. 113:147 -156.

［10］ Ohshima，H，Bartsch，H.，1994. Chronic Infections and In?ammatory Processes as Cancer Risk Factors:Possible Role of Nitric Oxide in Carcinogenesis. Mutat. Res. 305，253 –264.

［11］ 王懷穎，張秋燕，肖鋒，等.一氧化氮與衰老的研究［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2005，11(4):304 -306.