李喜紅 楊海新 張睿

骨由骨組織、骨膜及骨髓等構(gòu)成。骨組織是一種堅硬的有一定韌性的結(jié)締組織，它由大量鈣化的細(xì)胞間質(zhì)及數(shù)種細(xì)胞組成，鈣化的細(xì)胞間質(zhì)即稱為骨基質(zhì)。骨基質(zhì)由有機(jī)成分和無機(jī)成分構(gòu)成，含水極少，骨基質(zhì)中的有機(jī)成分由成骨細(xì)胞分泌形成，包括大量的膠原纖維(占有機(jī)成分的95%)及少量無定形基質(zhì)，無機(jī)成分又稱為骨鹽，主要為羥磷灰石結(jié)晶(Ca10(PO4)6(OH)2)，骨基質(zhì)的有機(jī)成分和無機(jī)成分緊密結(jié)合使骨十分堅硬，不能之間制成切片。

對骨組織脫鈣［1］是科學(xué)研究及病理檢測的常用技術(shù)，也是一大技術(shù)難點，要制作一張可用于免疫組化的骨組織切片并非容易。傳統(tǒng)的脫鈣方法主要有酸類脫鈣液、螯合劑(EDTA，乙二胺四乙酸二鈉)脫鈣液等。酸類脫鈣液雖脫鈣時間較短，但是常會破壞細(xì)胞形態(tài)及骨組織的正常結(jié)構(gòu)，影響病理觀察及免疫組化結(jié)果。目前在實驗室及臨床中常用不同濃度的EDTA脫鈣液對骨組織進(jìn)行脫鈣，這一方法不破壞骨組織的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，方便對其進(jìn)行分子水平的研究。

1 材料

在實驗室中獲得兔下頜骨標(biāo)本后，將下頜骨截斷制成長約2 cm的骨段。

2 脫鈣液的配制

本實驗中選用15%EDTA溶液作為研究對象，將150 gEDTA、800 ml蒸餾水及50 gNaOH充分?jǐn)嚢枞芙夂?，使用濃鹽酸調(diào)節(jié)PH值至7.0～7.5。

3 脫鈣方法

3.1 脫鈣前準(zhǔn)備 去除骨段表面的軟組織及骨膜，生理鹽水沖洗標(biāo)本后，放入中性福爾馬林溶液中固定24 h，取標(biāo)本于流動清水下沖洗20 min以清除骨組織表面的中性福爾馬林。將骨段平鋪于微波爐專用盒，倒入適量脫鈣液，使脫鈣液高度至少為骨段高度的20倍。因脫鈣溫度不宜過高，故脫鈣前進(jìn)行預(yù)實驗，將蒸餾水置于微波爐中中火輻射2 min，水溫可保持在45℃ ～65℃之間。脫鈣終點標(biāo)志為大頭針無阻力穿透骨組織。

3.2 15%EDTA微波脫鈣法 將盛有脫鈣液及骨段的微波爐專用盒置于微波爐中，中火間歇脫鈣，輻射時間為5 min/次，輻射間歇期間將標(biāo)本盒置于室溫下冷卻10 min，每天循環(huán)50次，每天更換脫鈣液，4 d后脫鈣完成。

3.3 15%EDTA低溫脫鈣法 將標(biāo)本盒置于4℃環(huán)境內(nèi)，每5 d更換脫鈣液，直至脫鈣成功共歷時47 d。

4 制片

脫鈣成功后將標(biāo)本常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、裱片、烤片、脫蠟、染色、中性樹膠封存。

5 結(jié)果

5.1 脫鈣時間 使用微波脫鈣法脫鈣時間較短，適合臨床病理檢查使使用。低溫脫鈣法脫鈣時間較長，更適合實驗室使用。

5.2 HE染色 制作HE染色切片過程中，微波脫鈣法脫鈣的標(biāo)本有部分切片出現(xiàn)脫片且切片時能明顯感覺到阻力略大，低溫脫鈣法切片容易，為出現(xiàn)脫片情況。兩種脫鈣方法處理的標(biāo)本制成的切片在鏡下觀察見骨組織結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)淺枚紅色，細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)紫色，兩者對比度強(qiáng)。微波脫鈣法脫鈣后制成的切片在高倍鏡下仍可見鈣化點的存在，低溫脫鈣法脫鈣后制成的切片鏡下未見鈣化點，視野清晰、干凈。

6 討論

最早的脫鈣方法是使用鹽酸、硝酸、硫酸等強(qiáng)酸溶液或醋酸、甲酸等有機(jī)酸進(jìn)行脫鈣，使用強(qiáng)酸脫鈣，雖然脫鈣時間較短，脫鈣效果也較好，但強(qiáng)酸對組織結(jié)構(gòu)破壞性較大致使染色效果不理想，而使用有機(jī)酸脫鈣作用較溫和，但脫鈣時間較長會致使組織膨脹同樣導(dǎo)致組織結(jié)構(gòu)改變，因此，不斷有學(xué)者改善脫鈣液配方，對于脫鈣前的固定過程，有學(xué)者在固定前通過血管灌注法使固定液滲入組織及細(xì)胞中，這種方法使固定更加充分和均勻，這一方法保證了切片質(zhì)量及染色質(zhì)量。近年來EDTA脫鈣液的使用越來越廣泛，逐漸成為可科學(xué)研究中首選的脫鈣劑，使用EDTA脫鈣不損傷組織及細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)及抗原等物質(zhì)的性質(zhì)，脫鈣效果較好，但脫鈣時間較長，不適宜需短時間內(nèi)完成脫鈣的標(biāo)本［2］，EDTA脫鈣液的濃度一般選擇10%左右，濃度過高或過低都會使脫鈣不充分或破壞組織結(jié)構(gòu)。為解決EDTA脫鈣時間較長這一缺點，有學(xué)者研究使用EDTA-微波輻射聯(lián)合脫鈣的方法，獲得了較好的效果，脫鈣時間明顯縮短，HE染色效果較好［3］，但使用這種方法脫鈣時加熱時間不好把握，且程序較為繁瑣不易掌握，容易過度脫鈣對標(biāo)本造成破壞。國外有學(xué)者經(jīng)過使用恒溫4℃環(huán)境下EDTA脫鈣的方法對骨組織進(jìn)行脫鈣取得較好效果。

本實驗中選擇的兩種脫鈣方法具有代表性，脫鈣液的濃度合適，未對細(xì)胞結(jié)構(gòu)造成破壞，EDTA微波脫鈣法可滿足臨床病理的需求，而EDTA低溫脫鈣法則更大程度的保存了細(xì)胞結(jié)構(gòu)，且對標(biāo)本完全脫鈣，保證了免疫組化檢測時定性定量的準(zhǔn)確性。

［1］龔志錦，詹榕洲.病理組織制片與染色技術(shù).上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1994:280.

［2］王穎，洪麗華，吳哲，等.口腔硬組織切片的固定脫鈣染色方法統(tǒng)計分析.吉林醫(yī)學(xué)，2007，28(11):1315-1316.

［3］姚麗艷，趙偉，呂紅兵.3中脫鈣液對牙體牙周聯(lián)合切片H-E染色效果的對比.福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2006，40(3):298-299.