陸慶明 邸春霞 張榮慶 王海昌

1.解放軍總醫(yī)院南樓外一科，北京 100853；2.解放軍第三〇九醫(yī)院心內(nèi)科，北京 100094；3.第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院心內(nèi)科，陜西西安 710032

內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells，EPC）是血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，亦稱為成血管細(xì)胞，即具有向成熟內(nèi)皮細(xì)胞分化的潛能，EPC 主要存在于骨髓、外周血、臍血等，在胚胎期參與胚胎血管生成，出生后的參與血管新生過程，其數(shù)量及功能變化直接影響到心血管系統(tǒng)的自我修復(fù)能力[1]。而且近年來的研究發(fā)現(xiàn)，EPC 可以作為內(nèi)皮損傷的標(biāo)志物，EPC 數(shù)量減少可以作為心血管事件獨(dú)立的危險(xiǎn)因素[2]。本研究擬在探討高血壓條件下EPC 數(shù)量及功能的變化，為闡明原發(fā)性高血壓及其血管并發(fā)癥發(fā)病機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)分組

將12只雄性自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）分為6周齡組和12周齡組，每組各6只，以同周齡正常雄性Wistar-Kyoto（WKY）大鼠（10只）分別為對(duì)照組，每組各 5只，均購(gòu)自第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，以RBP-1B型大鼠血壓計(jì)（中日友好臨床醫(yī)學(xué)研究所）連續(xù)測(cè)壓3次大鼠尾動(dòng)脈收縮壓取均值。

1.2 主要試劑

VEGF（Biovision 公司），M199 培養(yǎng)基（Gibco公司），b-FGF（Peprotech 公司），胎牛血清（Hyclone 公司），F(xiàn)ITC-UEA-1（Sigma 公司），Dil-ac-LDL（Invitrogen 公司），NO 檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程公司）。

1.3 EPC的分離與培養(yǎng)

頸椎脫臼法處死實(shí)驗(yàn)大鼠，取雙側(cè)股骨、脛骨、肱骨，去除兩端軟骨后以完全培養(yǎng)液反復(fù)沖洗骨髓腔，將得到的骨髓細(xì)胞懸液與淋巴細(xì)胞分離液以1∶1 比例混合后采用密度梯度離心法獲取單個(gè)核細(xì)胞，將單個(gè)核細(xì)胞接種于M199培養(yǎng)基（M199，VEGF 10 μg/L，bFGF 5 μg/L，10%FBS，L-谷氨酰胺 300 mg/L，青霉素 100 U/mL，鏈霉素 100 μg/mL），4 h后翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶去除貼壁細(xì)胞，未貼壁細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)促其二次貼壁，繼續(xù)培養(yǎng)7d后消化收集二次貼壁細(xì)胞接種于96 孔板中，將得到的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞化學(xué)分析。

1.4 細(xì)胞染色鑒定

細(xì)胞與 Dil-ac-LDL（10 μg/mL）在 37℃避光孵育 10 h，中性甲醛（2%）固定10 min，以PBS 液漂洗后加入FITCUEA-1（10 μg/mL），避光孵育 1 h。用多波長(zhǎng)激光共聚焦顯微鏡觀察Dil-ac-LDL 與FITC-UEA-1 雙染陽性細(xì)胞被認(rèn)為是正在分化的EPC。隨機(jī)選擇15 孔并在倒置熒光顯微鏡下（200倍視野）計(jì)數(shù)EPC。

1.5 EPC 增殖能力檢測(cè)

7d后消化收集二次貼壁細(xì)胞以1.0 ×104 細(xì)胞/孔的密度接種于96 孔板中，每孔加入10 μL MTT（5 mg/mL）溶液，繼續(xù)孵育4 h，每孔加入二甲基亞砜150 μL。微量震蕩器充分震蕩10 min后，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)吸光度值（波長(zhǎng) 490 nm）。

1.6 NO分泌能力檢測(cè)

消化培養(yǎng)7d的細(xì)胞，離心后加入完全培養(yǎng)液重懸，將細(xì)胞接種于96 孔板，接種密度為1.0 ×104 細(xì)胞/孔。將孔內(nèi)培養(yǎng)液上清收集后用硝酸還原酶法測(cè)定檢測(cè)各孔上清和濃度之和從而間接反映NO 含量。

1.7 凋亡檢測(cè)

消化培養(yǎng)7d的細(xì)胞，離心后加入完全培養(yǎng)液重懸，以1 000 r/min 離心5 min后棄上清，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡比例。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 10.0 軟件進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用成組t檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血壓

SHR 6周齡組平均血壓124.5～126.0 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa），WKY 6 周齡組平均血壓 114.8～116.5 mm Hg（P ＜0.05）；SHR 12 周齡組平均血壓 140.5～146.0 mm Hg，WKY 12周齡組平均血壓 117.8～120.4 mm Hg（P＜0.01）。

2.2 EPC的分離與鑒定

鏡下觀察分離得到的單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)過7d 誘導(dǎo)分化為梭形或多角形的內(nèi)皮樣細(xì)胞，多波長(zhǎng)激光共聚焦顯微鏡下以雙染法（Dil-ac-LDL 與 FITC-UEA-1）鑒定培養(yǎng)細(xì)胞，Dil-ac-LDL 染色陽性細(xì)胞在顯微鏡下激發(fā)出紅色熒光，而FITC-UEA-1 染色陽性細(xì)胞呈綠色熒光，而雙染陽性細(xì)胞即為正在分化的EPC 細(xì)胞。培養(yǎng)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果：SHR 6周齡組 EPC 數(shù)量[（38.7±4.3）個(gè)/視野（×200）]與對(duì)照組[（44.7±5.2）個(gè)/視野（×200）]相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。SHR 12周齡組 EPC 數(shù)量與對(duì)照組相比[（10.7±1.6）和（49.1±9.2）個(gè)EPC/視野（×200）]明顯減少（P＜0.01）。

2.3 原發(fā)性高血壓對(duì)EPC 增殖能力的影響

與對(duì)照組相比，SHR 6周齡組EPC 增殖能力略低 [吸光度值（0.174±0.009）和（0.213±0.012）]（P＜0.05）；SHR 12周齡組EPC 增殖能力較對(duì)照組明顯降低 [吸光度值（0.121±0.006）和（0.209±0.022）]（P＜0.05）。

2.4 原發(fā)性高血壓對(duì)EPC NO分泌的影響

SHR 6周齡組NO分泌較WKY 6周齡組減少 [（44.6±5.3）μmol/L 和（56.3 ±4.5）μmol/L]，（P＜0.05），SHR 12 周齡組NO分泌與對(duì)照組相比顯著下降[（37.5±1.4）μmol/L 和對(duì)照組（50.6±2.3）μmol/L]（P＜0.01）。

2.5 原發(fā)性高血壓對(duì)EPC 凋亡的影響

SHR 6周齡組EPC 凋亡率與WKY 6周齡組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 [（13.3±2.0）%和（11.7±0.2）%]（P＞0.05），SHR 12周齡組EPC 凋亡率與對(duì)照組相比顯著增加[（34.5±2.1）%和（10.7±0.4）%]（P＜0.01）。

3 討論

高血壓并發(fā)癥主要為心、腦、腎、大血管及眼底病變，其原因可分為“血壓升高因素”和“動(dòng)脈粥樣硬化因素”。前者可通過降低血壓水平而有效預(yù)防，而高血壓作為動(dòng)脈粥樣硬化最重要的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，降低血壓本身不能阻止動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程，血壓升高引起的內(nèi)皮細(xì)胞損害在其中起了重要的作用，啟動(dòng)動(dòng)脈粥樣硬化一系列反應(yīng)鏈。最初人們認(rèn)為當(dāng)血管內(nèi)皮損傷后，臨近損傷部位的健康內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖是主要的修復(fù)途徑。有學(xué)者從人外周血發(fā)現(xiàn)循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞，并在動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)EPC 能分化為成熟內(nèi)皮細(xì)胞[3]，后來的研究者在外周血、脾臟、骨髓、臍血中都分離出了EPC，并證實(shí)了EPC 有很高的增殖能力且能在VEGF、SDF-1等趨化因子的作用下歸巢到缺血組織參與新生血管形成[4]。EPC 在治療動(dòng)脈粥樣硬化性疾病和外周血管病的巨大的潛力使其成為近年來研究的熱點(diǎn)。

既往對(duì)EPC 活性及分布的研究表明，EPC 在胚胎期分布在配外中胚層卵黃囊血島，在成年個(gè)體中，EPC 在骨髓來源的單個(gè)核細(xì)胞中約占3%，在外周血單個(gè)核細(xì)胞中約占0.2%。心血管危險(xiǎn)因素與外周血EPC的數(shù)量、遷移功能呈顯著負(fù)相關(guān)[5]，國(guó)內(nèi)研究證實(shí)了患有冠心病的患者外周血EPC的數(shù)量減少，功能減退[6]。但上述研究均是抽取冠心病患者外周血，分離EPC 計(jì)數(shù)并檢測(cè)其功能，關(guān)于高血壓患者與EPC的研究較少，高血壓患者其骨髓來源EPC的數(shù)量和功能變化如何仍未有定論。

本研究的結(jié)果提示在高血壓條件下，骨髓來源EPC的數(shù)量減少，在SHR 6周齡組與對(duì)照組相比這種差異不明顯（P＞0.05），但隨著血壓增高及高血壓病程的延長(zhǎng)，骨髓來源EPC 數(shù)量顯著減少（P＜0.01）。SHR 6周齡組骨髓來源EPC 與對(duì)照組比較增殖能力、NO分泌能力均減退（均P＜0.05），細(xì)胞凋亡與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；12周齡SHR 骨髓來源EPC 與對(duì)照組比較EPC 增殖能力、NO分泌功能均明顯受損（均P＜0.01），細(xì)胞凋亡增多（P＜0.05）。說明隨著高血壓病程的發(fā)展骨髓來源EPC 功能逐漸受到損害，凋亡增多。

綜上所述，本研究證實(shí)了高血壓條件下骨髓來源EPC數(shù)量減少，功能減退，凋亡增多，且隨著血壓升高和高血壓病程的發(fā)展，高血壓對(duì)EPC的損害逐漸加重。為解釋高血壓血管并發(fā)癥的發(fā)生機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為進(jìn)一步了解EPC的生物活性和調(diào)節(jié)機(jī)制打下基礎(chǔ)。

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