高冬梅

（山東中醫(yī)藥大學中藥學博士后流動站，濟南250355）

當新世紀曙光升起的時候，人類基因組測序工作已接近尾聲，進一步了解基因產物及其相互關系及實現從基因結構到基因功能跨越的后基因組研究，已成為生命學科的熱切要求。應運而生的基因芯片技術給后基因組研究提供了有力的技術支持。與此同時，中醫(yī)界的一些有識之士也紛紛撰文憧憬著基因芯片技術在中醫(yī)藥研究的應用［1］。中藥品種繁多，如何篩選出有效中藥，進而從有效中藥中篩選出有效成分，并快速進行中藥毒理學研究，如何高效、快捷地應用于臨床，是中藥藥理研究的重大問題。傳統的方法學對逐個單味藥進行分析，進而對其不同有效成分（單體）進行實驗，其過程復雜，耗時多，投入量大，但產出卻很少。相反，如果采取高通量基因芯片篩選方法，快速篩選出有效成分，并快速完成毒理學實驗，并利用計算機系統綜合分析各種成分間相互作用關系，繪制出中藥復雜成分間相互作用的可能圖譜，有望大大加快中藥現代化進程，也為中藥產業(yè)化提供技術保障。

基因芯片又稱DNA微陣列技術，簡稱DNA芯片。最早是由E.Southern在1989年提出，是在芯片上按照特定的排列方式，固定上大量探針，形成一種DNA微矩陣，將樣品DNA／RNA擴增、體外轉錄等技術摻入標記分子后，與位于芯片的探針雜交通過同位素法、化學熒光法、化學發(fā)光法或酶標法顯示，利用計算機進行綜合分析，獲得樣品中大量基因序列及表達的信息。該技術具有高通量和平行檢測的優(yōu)勢。現就近10年基因芯片在中藥領域的應用與意義闡述如下。

1 基因芯片在中藥領域的應用

1.1 在基因水平上尋找藥物靶標，解釋藥物作用機制將中藥視為組合化學庫，篩選其中的有效成分，由此比較基因芯片上基因表達譜的變化，則有可能開發(fā)作用機制較明確的新中藥。采用所謂 “譯碼器”策略 （decoder strategy）來確定藥物靶標，從而找到 “導向藥物”或“特效藥”。當然，從中藥及其復方中篩選離子通道特異性調節(jié)劑、蛋白激酶抑制物或激活劑、細菌或腫瘤組織的耐藥性抑制劑等，都可采用基因或蛋白質芯片技術，將中藥及其復方直接作用于基因組或蛋白組，觀察特定基因表達或蛋白質構象或活性。傳統的膜片鉗或受體藥理方法發(fā)現，川芎嗪、粉防己甲素具有鈣通道拮抗劑作用，這種研究是復雜的。如果采用基因芯片，從人類基因庫中提取所有離子通道基因，采用芯片技術，在不同基因及其表達的蛋白上加上中藥，觀察中藥對基因表達或蛋白構象變化的影響，從而迅速了解此藥物的可能作用機制［2］。托婭等［3］利用基因芯片技術，從基因水平解釋抗腫瘤血管生成中草藥的有效組分T3d的分子機制，采用人胃癌BGC823細胞和血管內皮細胞 （EC），結果BGC823細胞組有2.53%基因表達譜發(fā)生明顯的變化，其中158條基因在經過T3刺激后表達量明顯上升，44條明顯下降。EC組有0.456%的基因表達譜發(fā)生明顯的變化，其中30條基因在經過T3刺激后表達量明顯上升，7條明顯下降。因此利用基因芯片技術可以從基因水平解釋中藥的作用機制［4－8］，為新藥的開發(fā)提供依據。

在新藥開發(fā)中，高通量的DNA芯片可發(fā)現眾多的新基因和新的靶分子用于新藥的設計。噬菌體展示技術可創(chuàng)造大量蛋白質，目前多用于抗體庫的建立和篩選，進而可用于受體－配體相互作用的研究。基因組學、蛋白質組學和生物信息學 （bioinformatics）將大大促進制藥工業(yè)的發(fā)展。目前第一個生物分子工程藥物Herceptin已用于乳癌的治療，并獲得美國FDA的批準。除腫瘤外，用分子生物工程設計的藥物可用于治療遺傳病及代謝疾病，延緩衰老，也可用分子生物工程技術設計新的抗生素和工業(yè)用酶等。同時，一種藥物的作用是多方面的，基因芯片有助于發(fā)現一種藥物的新功能。原先設想的作用是針對某一靶標的，但在全基因或廣范圍篩選中卻發(fā)現該藥在另一方面有很強的抑制作用，從而為開發(fā)成另一種新藥開辟新途徑。

1.2 鑒定藥物的潛在效應 基因芯片在用來研究藥物的作用機制時十分有用。Matron［9］等人利用基因芯片構建了免疫抑制性藥物FK506處理酵母細胞后的基因表達圖譜。發(fā)現用FK506處理的酵母細胞基因表達圖譜與FK506靶標的無意義突變體相似；而用FK506去處理此突變體，發(fā)現了不同于野生型的作用機制。Clarke等［10］應用基因芯片研究了腸癌患者化療前和治療期間腫瘤基因表達情況，發(fā)現絲裂霉素C和5－氟尿嘧啶治療均可使糖苷合成酶和尿嘧啶－DNA糖基酶的基因表達增加。該研究提示，這類研究既有助于闡明藥物的作用機制，也有助于確定藥物作用的靶基因，為新藥研究提供線索。通過這種方法能有效地篩選出有效中藥及其有效成分。

1.3 用于芯片毒理學研究 應用芯片查找藥物的毒性或不良反應，進行毒理學研究。尤其是慢性毒性和不良反應，普通的藥理學方法耗時長，需要的人力和物力多，而且還有可能遺漏某些可能存在的潛在毒性和不良反應。而在基因水平進行分析，觀察中藥對人體一些看家基因（house－keeping gene）成分是否具有影響，如細胞骨架基因、組蛋白基因等，便能徹底了解該中藥的可能毒性和不良反應。如果該藥能抑制重要基因的表達，則對它的深入研究就值得考慮。如果中藥中某種成分具有這種作用，那么對它進行改造時，就應該去除該成分，以便取長補短。目前國內尚未正式進行基因芯片的藥理學研究，但中藥藥理學研究可以借鑒西藥藥理研究方法，從而給中藥藥理研究帶來啟示。

在國外，利用芯片進行藥理學實驗已相當普及。Nuwaysir等［11］研制了包括涉及細胞凋亡、DNA復制和修復、氧化應激或氧化還原內穩(wěn)態(tài)、過氧化物酶體增殖反應、二惡英或多環(huán)芳烴反應、雌激素反應、看家基因、癌基因和抑癌基因、細胞周期控制、轉錄因子、激酶、磷酸酶、熱休克蛋白、受體、細胞色素P450等共2090個基因的毒理芯片 （Tox Chip v1.0），該芯片既可用于毒物的檢測和遺傳多態(tài)性的檢測，又可用于受檢毒物的毒性作用機制研究。2000年，牛津大學的Pennie等［12］構建了ToxBlot芯片，并對基因芯片技術應用于毒性機制和毒性預測進行了研究。ToxBlot芯片能夠完成有關內分泌的破壞、肝細胞毒性和胰島素敏感化合物骨髓毒性的研究。最近，Holden等從人和小鼠文庫中選擇約600個與毒理學相關基因的cDNA克隆，制備了種屬特異的病理基因組學芯片，可研究肝臟毒性、內分泌干擾、致癌作用等毒性終點的作用機制，也可用于確定以基因表達模式為基礎的化合物的毒性。此技術應用于毒理研究目前國內尚未見報道，但可以預見，如中藥藥理學研究引入基因芯片技術，將大大推動中藥研究的國際化進程，對闡明中藥作用機制，具有無可估量的重要意義。

1.4 有效中藥和中藥有效成分的大規(guī)模篩選 中藥的有效成分十分復雜，傳統的藥理研究方法周期長，耗時多，所需財力大，而采用基因芯片研究，將數千種不同中藥或中藥不同成分作用于一定的培養(yǎng)細胞后，甚至是人體的克隆細胞，觀察它們對基因表達的影響，從而能從基因組水平了解它們的作用機制與作用范圍，大大加快有效中藥和中藥有效成分的大規(guī)模篩選過程。另外，對新發(fā)現的中草藥的功能鑒定也起到一定的作用。目前，這種用于藥材鑒別的基因芯片仍處在研究階段，已有人對貝母進行特異性序列和鑒別芯片的實驗研究，相信不久的將來基因芯片就會廣泛應用于中醫(yī)藥領域［13］。

1.5 中藥復方研究 中藥復方成分復雜，傳統方法是將其中的中藥進行不同組合，進行 “拆方”、“組方”，從而推出復方的可能作用機理，而且其作用僅限于研究的某一方面或幾方面作用，很難對該復方有全面的認識，尤其是對新功能的認識和開發(fā)。而采用基因芯片技術，能迅速了解該復方對基因組中某些基因表達的影響，從而不僅了解該復方的原有功能，還有可能很輕易地發(fā)現該復方組方后可能出現的新功能，為復方的新功能開發(fā)提供了客觀依據［2］。

2 存在問題及展望

2.1 存在問題：①由于人類基因組測序尚未完成，許多基因還不明朗，因此，基因芯片由于所含基因數不全，以致大量的可能有變化的基因漏網，而明顯影響到研究結果。正由于如此，在目的類似的DDPCR實驗中可以發(fā)現許多新的基因片段。②以動物模型為工具進行各項研究，由于此動物 （小鼠、大鼠等）的基因測序工作還沒有大面積展開，需要更晚些時候才能完成。③由于哺乳類動物基因組數量大，測同一細胞組織，就目前的基因芯片規(guī)模，整個基因組需要許多塊芯片，研究工作量和研究成本會很高而且研究費用高昂。④實驗數據龐大，且大量的基因功能還不明朗，因此給進一步研究帶來困難。⑤基因芯片技術本身存在假陽性率偏高，較嚴重影響臨床應用價值；其次是首先要對標本進行PCR擴增，增加操作復雜性［14］。

2.2 發(fā)展前景 雖然有問題存在，但基因芯片技術為生命科學展現出絢麗的前景：①隨著人類、大鼠、小鼠，甚至兔、狗、猴等基因組測序完成，將有可能生產出全套基因組芯片，使基因芯片在生命科學、醫(yī)學等相關領域應用。②當基因芯片生產技術趨于成熟，可能會大批量生產，將有可能降低生產成本，降低售價，易于普及。③一旦類似高效的蛋白芯片技術的解決，與基因芯片的配套使用，將會對生命科學研究取得質的突破。④多學科交叉，各項技術向縱深。例如計算機技術的發(fā)展，讀片分析自動化程度增加，將使基因芯片技術更加完善、實用。⑤不同基因功能研究的積累，以及基因功能研究技術的發(fā)展與普及，使基因芯片研究的后續(xù)工作得以有效地開展，基因芯片的科學價值即實用價值將得到充分的體現和迅速發(fā)展［1］。

［1］方肇勤.基因芯片技術及其在中醫(yī)基礎實驗研究中的應用［J］.上海中醫(yī)藥大學學報，2001，1（15）：17－19.

［2］張發(fā)寶，李欣梅.基因芯片技術在中醫(yī)藥研究中的應用［J］.安徽中醫(yī)學院學報，2002，3（21）：57－59.

［3］托婭，蘇秀蘭.基因芯片在抗腫瘤血管生成中草藥相關基因篩選中的研究［J］.第二軍醫(yī)大學學報，2002，23（3）：273－275.

［4］王興，任敏.糖腎平膠囊對糖尿病小鼠大血管基因表達的影響［J］.中國天然藥物，2005，1（3）：53－55.

［5］王波，李玉.明胰島素抵抗高血壓大鼠基因表達譜和糖脂消對其的影響［J］.介入放射學雜志，2004，12（2）：205－212.

［6］Wu Yu，Yang Yu－fei，Dong－Hua.Microarray gene chip analysis and action of yiyiren oil on anti－tumor metastasis reactive gene［J］.Chinese Journal Clinical Rehabilitation，2005，22（9）：265－269.

［7］張小燕，張占軍，王忠.梔子苷對局灶性腦缺血大鼠腦組織基因表達譜的影響［J］.中國中西醫(yī)結合雜志，2005，1（25）：42－44.

［8］王米渠，許景文.中醫(yī)研究與基因組學及基因芯片技術［J］.江西中醫(yī)學院學報，2002，3（14）：62－64.

［9］Matron MJ，Derisive JL，Bennett HA.Drug target validation and identification of secondary drug target effect using DNA microarray［J］.Nature Medicine，1998，4：1293－1301.

［10］Clarke PA，George M，Cunningham D.Analysis of tumor gene expression following chemotherapeutics of patients with bowel cancer［J／OL］［J］.Nat Am Inc.1999.

［11］Nuwaysir EF，Bittner M，Trent J.Microarrays and toxicology：The advent of toxicogenomics［J］.Mol Carcinog，1999，24（3）：153－159.

［12］Pennie Wd.The priciples and practices of toxicogenomics：application and opportunities［J］.Toxicol Sci，2000，4（2）：227.

［13］楊光明，蔡寶昌.分子生物下學技術在中藥鑒定中的應用［J］.世界科學技術－中藥現代化，2001，4（3）：29－37.

［14］成軍.基因芯片技術的原理及其在肝病研究中的應用［J］.中華肝病雜志，2002，4（8）：302.