黃月純

中藥專業(yè)研究生培養(yǎng)系列之HPLC含量測定帶教探討

黃月純

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣州510405）

中藥專業(yè)研究生培養(yǎng)是醫(yī)院藥學(xué)部教學(xué)計(jì)劃中的組成部分，是培養(yǎng)研究生技能的重要橋梁之一，本文對中藥學(xué)研究生培養(yǎng)中最基本、最常用的中藥分析技術(shù)HPLC含量測定的帶教培養(yǎng)進(jìn)行探討。

中藥專業(yè)；碩士研究生培養(yǎng)；高效液相色譜法；帶教

中藥學(xué)專業(yè)研究生的培養(yǎng)是大型綜合性醫(yī)院藥學(xué)部（藥劑科）教學(xué)計(jì)劃中的組成部分，是培養(yǎng)研究生技能的重要橋梁之一。高效液相色譜法（HPLC）含量測定是藥物分析最常用的技術(shù)，不僅是中藥質(zhì)量研究方向研究生應(yīng)掌握的技術(shù)，也是制劑工藝研究方向研究生應(yīng)掌握的技術(shù)，此外有些從事藥理方向研究生也會(huì)涉及到HPLC技術(shù)。HPLC含量測定是研究生階段從事質(zhì)量分析研究的基礎(chǔ)，是質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究的前提。在大學(xué)本科階段，真正掌握了HPLC含量測定方法相關(guān)儀器操作、實(shí)驗(yàn)過程操作、方法調(diào)整、數(shù)據(jù)分析處理等技術(shù)的學(xué)生不多，因此，有必要把HPLC含量測定作為研究生技能培養(yǎng)系列內(nèi)容之一。本文對高效液相色譜儀原理、操作技能、含量測定標(biāo)準(zhǔn)方法解讀及應(yīng)注意的實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)等方面的帶教培養(yǎng)進(jìn)行探討，以培養(yǎng)研究生的操作技能以及提高分析和解決實(shí)際問題的能力。

1 介紹高效液相色譜儀原理 培訓(xùn)儀器操作技能

目前國內(nèi)常用的高效液相色譜儀的生產(chǎn)廠家主要有Agilent、Waters、島津、戴安等。檢測器有紫外檢測器（含二極管陣列檢測器）、熒光檢測器、蒸發(fā)光散射檢測器、示差折光檢測器、電化學(xué)檢測器、質(zhì)譜檢測器等。紫外、熒光、電化學(xué)檢測器為選擇性檢測器，其響應(yīng)值不僅與供試品溶液的濃度有關(guān)，還與化合物的結(jié)構(gòu)有關(guān)。不同檢測器原理有較大差異，不同廠家儀器的操作系統(tǒng)亦有不同，而且在本科階段，大多學(xué)生只是了解了高效液相色譜儀的基本原理，少有機(jī)會(huì)進(jìn)行實(shí)際操作。因此，研究生在使用高效液相色譜儀前，應(yīng)先進(jìn)行高效液相色譜儀的原理介紹，針對實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的儀器型號進(jìn)行操作規(guī)程的介紹、操作技能培訓(xùn)以及必要的維護(hù)等。

2 選擇示范的含量測定標(biāo)準(zhǔn)方法 了解學(xué)生對標(biāo)準(zhǔn)方法的掌握程度

2.1 示范的含量測定標(biāo)準(zhǔn) 如枇杷葉中齊墩果酸和熊果酸的含量測定［1］。

含量測定參照高效液相色譜法測定。

色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-甲醇-0.5%醋酸銨溶液（67∶12∶21）為流動(dòng)相；檢測波長為210nm。理論板數(shù)按熊果酸峰計(jì)算應(yīng)不低于5000。

對照品溶液的制備：取齊墩果酸對照品、熊果酸對照品適量，精密稱定，加乙醇制成每1ml含齊墩果酸50μg，熊果酸0.2mg的混合溶液，即得。

供試品溶液的制備：取本品粗粉約1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入乙醇50ml，稱定重量，超聲

處理（功率250W，頻率50k Hz）30分鐘，放冷，再稱定重量，加乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

測定法：分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10μl，注入液相色譜儀，測定，即得。

本品按干燥品計(jì)算，含齊墩果酸（C30H48O3）和熊果酸（C30H48O3）的總量不得少于0.70%。

2.2 了解研究生對方法的掌握程度 針對標(biāo)準(zhǔn)方法，可先讓研究生擬定詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)步驟，以便了解學(xué)生對標(biāo)準(zhǔn)方法的了解及掌握程度。

3 詳細(xì)分析含量測定標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)目內(nèi)容及應(yīng)注意的實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)

雖然標(biāo)準(zhǔn)只規(guī)定了幾行，但包含了較多的信息及要求，需要研究生對標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)目進(jìn)行深入了解，才能避免實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)差錯(cuò)。

3.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

3.1.1 適宜型號色譜柱的選擇 高效液相色譜法多采用反相高效液相色譜，標(biāo)準(zhǔn)中一般采用以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（即C18柱），C18柱的廠家、型號、規(guī)格很多，一般標(biāo)準(zhǔn)未規(guī)定C18柱型號、規(guī)格，可采用進(jìn)口或國產(chǎn)C18柱。不同C18柱對色譜峰的保留時(shí)間往往有較大差異，可通過調(diào)節(jié)流動(dòng)相比例以達(dá)到合適的分離效果。但有些樣品特別是同時(shí)測定多種含量的樣品的分離度對色譜柱要求相對較嚴(yán)，當(dāng)分離度達(dá)不到要求時(shí)，可參考文獻(xiàn)報(bào)道方法，選擇合適的色譜柱型號、規(guī)格。如紅參［1］中人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1的含量測定，采用Zorbax SB C18柱（250×4.6mm，5μm），人參皂苷Rg1與人參皂苷Re的分離度相對較好。如地黃［1］中梓醇的含量測定，以乙腈-0.1%磷酸溶液（1∶99）為流動(dòng)相，有機(jī)相乙腈所占比例很小，采用一般C18柱進(jìn)行分析，保留時(shí)間太短，如采用全水相柱［如Zorbax SB Aq柱（250×4.6mm，5μm）］則可延長保留時(shí)間。在研究生帶教時(shí)，應(yīng)對學(xué)生介紹十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的含義，也應(yīng)簡單介紹C18柱型號、規(guī)格的必要性，同時(shí)也要讓學(xué)生查詢有關(guān)研究的參考文獻(xiàn)，選擇適宜的色譜柱。

3.1.2 檢測波長的固定及參數(shù)的優(yōu)化 檢測波長是HPLC測定最重要的參數(shù)，紫外、熒光、電化學(xué)檢測器均規(guī)定了檢測波長。標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的檢測波長固定，不允許更改，但在儀器的一些參數(shù)（帶寬、參比波長、峰寬、狹縫）選擇方面則是應(yīng)進(jìn)行優(yōu)化選擇。以Agilent公司儀器為例，使用較寬的帶寬有降低噪聲的優(yōu)點(diǎn)，如使用30nm帶寬比4nm帶寬基線噪聲降低約2.5倍，而信號值是4nm帶寬的75%，一般情況選擇4、8nm帶寬即可；參比波長一般可不選擇，但有些成分分析的基線漂移嚴(yán)重（如氨基酸），則使用參比波長對基線有明顯改善；峰寬（響應(yīng)值）應(yīng)盡可能接近要測的窄峰峰寬，可選“2s”或“4s”；窄狹縫（如4nm）光譜分辨率高，一般檢測可選用，寬狹縫（如8、16nm）噪音低，當(dāng)采用末端檢測波長（如203nm）可選用，如枇杷葉中齊墩果酸和熊果酸的含量測定，流動(dòng)相為乙腈-甲醇-0.5%醋酸銨溶液（67∶12∶21），檢測波長為210nm，狹縫選擇16nm，基線噪音較?。?］。對于帶寬、參比波長、峰寬、狹縫等要求在標(biāo)準(zhǔn)未注明，需要提醒學(xué)生注意。

3.1.3 流動(dòng)相系統(tǒng)組成的固定及比例的調(diào)整 流動(dòng)相系統(tǒng)是實(shí)驗(yàn)中容易發(fā)生誤區(qū)的地方，大多學(xué)生以為流動(dòng)相系統(tǒng)比例是固定、不可改變的，拿到標(biāo)準(zhǔn)或參考方法一成不變進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果往往不理想，如目標(biāo)色譜峰的保留時(shí)間太短、分離度下降或保留時(shí)間太長、峰變寬，理論板數(shù)不符合要求等。因此，在帶教中應(yīng)向?qū)W生明確標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的流動(dòng)相系統(tǒng)（如甲醇-水、乙腈-0.1%磷酸）是固定的，但色譜峰保留時(shí)間及分離度易受不同色譜柱、流速、柱溫、室溫、流動(dòng)相廠家等因素影響，應(yīng)根據(jù)初試結(jié)果，進(jìn)行流動(dòng)相比例的調(diào)整。流動(dòng)相一般為有機(jī)相與水相組成，可采用泵的兩個(gè)通路；有些為三種組成，如枇杷葉中齊墩果酸和熊果酸含量測定的乙腈-甲醇-0.5%醋酸銨溶液（67∶12∶21），可采用泵的三個(gè)通路。對于非梯度系統(tǒng)的系統(tǒng)，也可將有機(jī)相與水相混合后在一個(gè)通路中進(jìn)行試驗(yàn)。

3.1.4 流速、柱溫的選擇 一般標(biāo)準(zhǔn)未規(guī)定流速、柱溫，可采用常規(guī)流速1ml／min，柱溫可為室溫10～30℃，有柱溫箱條件的儀器可設(shè)定溫度，如25℃、30℃等。

3.1.5 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)的要求 《中國藥典》2010年版附錄ⅥD“高效液相色譜法”項(xiàng)下明確了適用性試驗(yàn)通常包括理論板數(shù)、分離度、重復(fù)性和拖尾因子等四個(gè)參數(shù)。在標(biāo)準(zhǔn)中各品種項(xiàng)下一般只規(guī)定了理論板數(shù)，其他參數(shù)參考附錄執(zhí)行，這部分要求往往是學(xué)生容易忽視的地方。因此，在HPLC含量測定技能培訓(xùn)中，應(yīng)指導(dǎo)學(xué)生學(xué)習(xí)附錄相關(guān)要求。對于不同待測成分、不同品種項(xiàng)下某些相同待測成分的理論板數(shù)規(guī)定有差異，應(yīng)選擇適宜型號的色譜柱及調(diào)整流動(dòng)相比例使理論板數(shù)符合標(biāo)準(zhǔn)要求。待測峰與相鄰峰的分離度應(yīng)大于1.5。在系統(tǒng)適用性試驗(yàn)中的重復(fù)性用于評價(jià)連續(xù)進(jìn)樣色譜系統(tǒng)響應(yīng)值的重復(fù)性能。采用外標(biāo)法時(shí)通常取對照品溶液連續(xù)進(jìn)樣5次，測定峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于2.0%。拖尾因子用于評價(jià)色譜峰的對稱性，在峰高法定量時(shí)作要求，而峰面積法測定時(shí)，除拖尾嚴(yán)重外作出特殊規(guī)定外，一般不作要求。

3.2 對照品溶液的制備 對照品濃度配制準(zhǔn)確與否直接影響到含量測定結(jié)果，因此在操作前應(yīng)對學(xué)生進(jìn)行明確說明可能出現(xiàn)及應(yīng)注意的問題。一般在保存條件良好的對照品按要求配制即可；有些對照品需干燥后取樣（如黃芩項(xiàng)下的黃芩苷對照品應(yīng)60℃減壓干燥4小時(shí)后稱量［1］），應(yīng)按要求干燥；有些成分（如金銀花項(xiàng)下的綠原酸［1］）遇光容易分解，需配制在棕色瓶中。由于對照品溶液濃度較?。ㄓ行﹥H為10μg／ml），因此應(yīng)向?qū)W生明確使用的電子天平精度應(yīng)為十萬分之一。對于配制的濃度應(yīng)盡可能與標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的濃度相一致，具體應(yīng)根據(jù)稱量時(shí)的具體重量而定。有些對照品溶解性差（如大黃含量測定項(xiàng)下的大黃素等五種游離蒽醌［1］），必要時(shí)應(yīng)加熱處理或超聲處理使溶解。由于對照品較昂貴，配制的對照

品濃度應(yīng)注明濃度、配制日期，使用后密閉置冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

3.3 供試品溶液的制備 藥材或飲片應(yīng)按要求粉碎成一定的粉碎度，如粗粉、粉末（過四號篩）等。取樣應(yīng)精密稱定，宜使用精度為萬分之一的電子天平，至少取樣兩份?？紤]學(xué)生操作技能的熟練程度及可能造成的誤差，取樣量三份較適宜。研究生通過本科教育一般基本掌握了樣品的制備方法，容易出現(xiàn)誤差的地方大多對定量操作把握程度不夠，因此，主要針對不足進(jìn)行稱重、量取、定容等細(xì)節(jié)進(jìn)行技能培訓(xùn)。另外應(yīng)對規(guī)定“按干燥品計(jì)算”進(jìn)行補(bǔ)充，除另有規(guī)定外，應(yīng)取未干燥的供試品進(jìn)行試驗(yàn)，并將計(jì)算中的取樣量按［檢查］項(xiàng)下測得的水分扣除。

3.4 測定法 標(biāo)準(zhǔn)中要求分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各一定量，注入液相色譜儀，測定對照品溶液及供試品溶液中待測成分的峰面積，按一定的公式計(jì)算含量。HPLC法測定含量常采用外標(biāo)法計(jì)算含量。對于進(jìn)樣量問題，研究生也常有誤區(qū)，認(rèn)為不可改變，實(shí)際上有時(shí)應(yīng)根據(jù)需要進(jìn)行調(diào)整。如某些型號色譜柱對某些色譜峰分離度不佳，特別是以甲醇-水為流動(dòng)相系統(tǒng)，供試品溶液以甲醇為溶媒的條件下，常出現(xiàn)前沿峰，理論板數(shù)下降，如青皮項(xiàng)下橙皮苷含量測定規(guī)定進(jìn)樣量為10μl［1］，改為5μl峰形明顯變得尖銳；有時(shí)某些色譜峰（如綠原酸）在進(jìn)樣量較大（10μl）時(shí)出現(xiàn)雙峰，改為5μl則為僅為單峰而且峰形明顯變得尖銳。

4 選擇需要實(shí)驗(yàn)的中藥 讓研究生參與實(shí)驗(yàn)全過程

在進(jìn)行系列培訓(xùn)后，選擇需要實(shí)驗(yàn)的內(nèi)容，讓研究生擬定詳細(xì)可行的操作步驟，導(dǎo)師檢查后，讓研究生獨(dú)立進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的全過程。

本文把HPLC含量測定作為研究生技能培養(yǎng)系列內(nèi)容之一，對中藥學(xué)碩士進(jìn)行了培訓(xùn)探討，以期有效地提高研究生的實(shí)驗(yàn)操作技能、提高質(zhì)量研究分析能力。

［1］國家藥典委員會(huì)．中國藥典（一部）［S］．北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：190，143，115，282，205，22，182．

10.3969／j.issn.1672-2779.2013.21.063

1672-2779（2013）-21-0083-03

楊 杰

2013-07-21）