杜 鵬，木依提，欒新平，賈宏宇，苑 楊，徐敬軒，張晶晶

不同部位誘發(fā)癲癇動(dòng)物模型對(duì)比研究

杜 鵬，木依提，欒新平，賈宏宇，苑 楊，徐敬軒，張晶晶

目的 探討鐵離子不同部位誘發(fā)外傷性癲癇動(dòng)物模型的穩(wěn)定性和可靠性。方法 健康成年雄性大鼠50只，隨機(jī)分為5組:SDA、SDB、SDC、SDD、SDE，各10只，其中SDA、SDB為對(duì)照組;SDC、SDD、SDE為癲癇模型組，采用不同方法制備癲癇模型，點(diǎn)燃成功后，收集行為表現(xiàn)、腦電圖、組織病理等3方面資料，行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果 研究結(jié)果顯示SDC、SDD、SDE均能點(diǎn)燃癲癇動(dòng)物模型，其中SDD點(diǎn)燃動(dòng)物模型出現(xiàn)早，持續(xù)時(shí)間短，不適合作為人類癲癇基礎(chǔ)研究;組織病理方面，SDA和SDB比較P＞0.05，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，排除實(shí)驗(yàn)干擾導(dǎo)致海馬CA1神經(jīng)元細(xì)胞丟失;SDC、SDD、SDE均能使CA1區(qū)錐體細(xì)胞數(shù)減少，與對(duì)照組相比P＜0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;對(duì)側(cè)相比P＜0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;3組同側(cè)之間比較P＞0.05，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 額葉皮層運(yùn)動(dòng)區(qū)注射鐵離子操作簡(jiǎn)單、成功率高、可靠性好，相比于其他兩種，更為適合外傷性癲癇基礎(chǔ)研究和藥物研究。

鐵離子;外傷性癲癇;動(dòng)物模型

外傷性腦損傷后紅細(xì)胞外滲、溶解和含鐵血黃素沉積于神經(jīng)組織內(nèi)，引起一系列的病理變化，導(dǎo)致癲癇發(fā)作，是外傷性癲癇(posttraumatic epilepsy，PTE)產(chǎn)生基礎(chǔ)。目前外傷性癲癇(PTE)包括液壓打擊模型、自由落體模型、鐵模型、皮層底切模型、控制性皮層撞擊模型［1］。鐵離子在癲癇形成中所起作用已得到了絕大多數(shù)臨床醫(yī)師的肯定。為此我們采取鐵離子不同方法制備癲癇動(dòng)物模型，以探討鐵離子誘導(dǎo)PTE實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的穩(wěn)定性和可靠性。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 健康成年雄性SD (Sprague Dawley)大鼠(由新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)50只，體重180～220g，動(dòng)物模型隨機(jī)分為5組:正常對(duì)照組(SDA)、假手術(shù)對(duì)照組(SDB)、鐵離子皮層注射致癲癇組(SDC)、鐵離子導(dǎo)入組(SDD)、鐵離子杏仁體注射組(SDE)各10只，共計(jì)50只動(dòng)物。

1.2 癲癇模型制作 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以10%水合氯醛(350m/g)腹腔麻醉，固定于立體定向架上，根據(jù)注射部位確定鉆顱部位。鉆開顱骨，根據(jù)包新民［2］等大鼠腦立體定位圖譜，微量進(jìn)樣器緩慢進(jìn)針至靶點(diǎn)(大鼠右額葉皮質(zhì)坐標(biāo)為:前囟前2.0mm、中線旁3.0mm、硬膜下2.0mm;杏仁核坐標(biāo)為:前囟后2.8 mm、中線旁4.8mm、硬膜下8.0～8.5mm)。SDB組在右額葉皮質(zhì)坐標(biāo)區(qū)、杏仁核坐標(biāo)區(qū)注人等量的生理鹽水;SDC組為右額葉皮質(zhì)內(nèi)注射FeCl2(0.1mol/ L)10μl;SDD組方法為在右額葉皮層坐標(biāo)區(qū)鉆孔，星狀切開硬腦膜。將尖端塞有棉花(防止細(xì)管內(nèi)的FeCl3溶液溢出過(guò)快)的導(dǎo)入管尖端與軟腦膜輕接觸，細(xì)管內(nèi)注有濃度為100mmol/L、pH值為1.5的FeCl3溶液。將一輸出電流為100μA的電源的正、負(fù)極各連一針灸針。正極的針灸針插入細(xì)管內(nèi)的FeCl3溶液中，負(fù)極的針灸針插入大鼠右前肢皮下，通電10min;SDE組方法為在杏仁核坐標(biāo)區(qū)注入Fe－CI2(0.1mol/L)1μl。

1.3 行為學(xué)觀察 按照Racinel經(jīng)典的癲癇發(fā)作行為評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行癲癇行為的觀察和記錄［3］:無(wú)任何癲癇發(fā)作行為記0分;凝視發(fā)作記1分;出現(xiàn)規(guī)律性點(diǎn)頭或濕狗樣抖動(dòng)，伴有或不伴有面部抽動(dòng)記2分;出現(xiàn)一側(cè)前肢震顫記3分;站立、雙前肢震顫及持續(xù)性點(diǎn)頭記4分;雙前肢震顫加重，失去平衡跌倒而出現(xiàn)全身性強(qiáng)直一陣攣性發(fā)作記5分;發(fā)作衰竭導(dǎo)致死亡記6分。各組大鼠給予視頻錄像監(jiān)測(cè)，連續(xù)觀測(cè)30d。

1.4 腦電圖描記 于右額及右枕各鉆一孔安裝不銹鋼電極，參考電極放置右耳，連接于POWERLAB生理記錄儀。模型制備前、后60min分別記錄動(dòng)物的腦電變化。每組大鼠接受處理前后各描記腦電圖1h，首先連續(xù)記錄15min，然后每隔5min記錄10min，1h內(nèi)完成。腦電圖資料用POWERLAB隨機(jī)軟件計(jì)算出癇樣放電潛伏期、頻率和波幅。根據(jù)Racine分級(jí)［3］，4級(jí)以上發(fā)作，腦電圖在尖波或棘波的基礎(chǔ)上出現(xiàn)陣發(fā)性或持續(xù)性異常放電為模型成功，以成功率表示。成功率的計(jì)算公式:(每組模型成功大鼠數(shù)/每組人選制模大鼠數(shù))×100%。

1.5 組織學(xué)觀察(HE染色、鐵的染色及Nissl染色)FeCl2注射30d后腹腔麻醉，經(jīng)左心室一升主動(dòng)脈插管灌注生理鹽水150ml、含4%多聚甲醛的0.1mol/PB(pH7.4，4℃)300ml取出大腦，常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋。額葉(注射點(diǎn)層面)及海馬層面連續(xù)冠狀切片(厚3μm，每隔10片取2片)。行HE染色、鐵的染色及Nissl染色。光鏡(40×10倍)下雙盲法連續(xù)計(jì)數(shù)2個(gè)視野雙側(cè)CA1區(qū)錐體細(xì)胞和齒狀回(DG)細(xì)胞。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS16.0進(jìn)行t檢驗(yàn)，各組之間大鼠行為學(xué)評(píng)分、各組之間及兩側(cè)海馬CA3區(qū)錐體細(xì)胞數(shù)兩兩比較用LSD檢驗(yàn)，各組成功率兩兩比較用χ2檢驗(yàn)，取α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 行為表現(xiàn)差異 各組的Racinel癲癇發(fā)作行為評(píng)分比較顯示:第一天，SDD組與其他各組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。其中，SDD組與SDA組、SDB組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明SDD組可以誘發(fā)癲癇，與SDC組、SDE組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明SDD組誘發(fā)癲癇行為表現(xiàn)更為典型。SDC組、SDE組與SDA組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明均能點(diǎn)燃癲癇動(dòng)物模型。第15天和第30天，SDD組與SDA組、SDB組、SDC組、SDE組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明隨時(shí)間推移，癲癇行為逐漸消失，說(shuō)明維持時(shí)間不長(zhǎng)，SDA組、SDB組與SDC組、SDE組比較顯示SDC組、SDE組誘發(fā)癲癇行為隨時(shí)間推移，行為表現(xiàn)越來(lái)越典型(見(jiàn)表1)。由此得出，SDD組不穩(wěn)定，而SDC組、SDE組更趨向穩(wěn)定。SDC組與SDE組在第1天、第15天、第30天對(duì)比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 腦電圖和病理結(jié)果差異比較 SDA組、SDB組腦電圖表現(xiàn)為正常腦電圖，而SDC組、SDD組與SDE組腦電圖監(jiān)測(cè)異常率分別為92%、95%、93%。說(shuō)明，有行為學(xué)異常表現(xiàn)時(shí)腦電圖上均有表現(xiàn)，結(jié)合行為學(xué)和腦電圖更加證明癲癇模型誘發(fā)成功。SDA組與SDB組對(duì)比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，而SDC組、SDD組、SDE組兩側(cè)對(duì)比，以及同側(cè)與SDA組、SDB組同側(cè)對(duì)比顯示CA1區(qū)錐體細(xì)胞數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(見(jiàn)表2)。

表1 各組動(dòng)物模型1d、15d、30d Racinel癲癇發(fā)作行為評(píng)分比較

表2 各組兩側(cè)CA1區(qū)錐體細(xì)胞數(shù)變化

3 討論

一個(gè)較理想的癲癇模型應(yīng)具有和人類癲癇相似的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。至少應(yīng)具備以下特征［4］:(1)具有諸如神經(jīng)細(xì)胞丟失、膠質(zhì)細(xì)胞增生、軸突絲狀芽生和突觸重建等與人類癲癇相似的病理學(xué)基礎(chǔ);(2)在初始刺激與自發(fā)性癲癇發(fā)作之間有較為固定的潛伏期(數(shù)天至數(shù)周);(3)模型在一定時(shí)間內(nèi)保持大腦神經(jīng)元興奮性持續(xù)增高。本試驗(yàn)通過(guò)建立動(dòng)物模型，從行為、腦電圖、組織病理3方面探討鐵離子不同方法誘發(fā)的癲癇動(dòng)物模型不同點(diǎn)。目的在于便于尋找一種最為接近人類的癲癇動(dòng)物模型。

實(shí)驗(yàn)研究表明，結(jié)合行為和腦電圖兩方面發(fā)現(xiàn)鐵離子皮層注射、鐵離子導(dǎo)入蛛網(wǎng)膜下腔、鐵離子杏仁體注射均能導(dǎo)致癲癇發(fā)生，均能點(diǎn)燃癲癇動(dòng)物模型，鐵離子導(dǎo)入蛛網(wǎng)膜下腔導(dǎo)致的動(dòng)物模型產(chǎn)生的癥狀主要位于第一天，隨后逐漸恢復(fù)正常。而人類癲癇存在初始刺激與自發(fā)性癲癇發(fā)作之間有較為固定的潛伏期(數(shù)天至數(shù)周)，故鐵離子導(dǎo)入蛛網(wǎng)膜下腔動(dòng)物模型與其他兩種相比，不適合作為人類難治性癲癇的藥物、發(fā)病機(jī)制研究。但早期誘發(fā)出強(qiáng)烈癲癇，成功率高(95%)模擬人類蛛網(wǎng)膜下腔出血所產(chǎn)生的癲癇，故有利于蛛網(wǎng)膜下腔出血所致癲癇的研究。運(yùn)動(dòng)皮層、杏仁體注射誘發(fā)癲癇動(dòng)物模型，從行為表現(xiàn)方面、腦電圖無(wú)差異，但杏仁體注射動(dòng)物模型制備和額葉運(yùn)動(dòng)皮層比較，相對(duì)要困難，故額葉皮層注射鐵離子更適合人類癲癇及難治性癲癇發(fā)病機(jī)制、藥物治療等基礎(chǔ)研究。文獻(xiàn)上，已應(yīng)用杏仁體注射鐵離子的方法建立PTE動(dòng)物模型進(jìn)行有關(guān)的基礎(chǔ)研究，但臨床上額葉皮層的損傷遠(yuǎn)比單純杏仁體損傷常見(jiàn)。額葉皮層注射容易定位，易于推廣，更符合臨床上顱腦創(chuàng)傷的特點(diǎn)，是局灶性外傷性癲癇的較為理想的模型制作方法。

顳葉癲癇術(shù)中切除病灶和癲癇灶腦組織發(fā)現(xiàn)人類癲癇病理最常見(jiàn)的病理學(xué)改變?yōu)榫植可窠?jīng)元細(xì)胞變性、丟失，尤其以CA1區(qū)錐體細(xì)胞喪失最為嚴(yán)重，以及膠質(zhì)細(xì)胞增生甚至膠質(zhì)化結(jié)節(jié)形成［5］。此實(shí)驗(yàn)研究最后將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處死海馬CA1區(qū)制備病理切片發(fā)現(xiàn):SDA組與SDB組對(duì)比說(shuō)明排除實(shí)驗(yàn)干擾導(dǎo)致海馬CA1神經(jīng)元細(xì)胞丟失，同時(shí)，SDC組、SDD組、SDE組兩側(cè)對(duì)比，以及同側(cè)與SDA組、SDB組同側(cè)對(duì)比說(shuō)明鐵離子皮層注射、鐵離子導(dǎo)入蛛網(wǎng)膜下腔、鐵離子杏仁體注射誘導(dǎo)癲癇后同側(cè)CA1區(qū)錐體細(xì)胞減少，對(duì)側(cè)不受影響。說(shuō)明一側(cè)有明確癲癇致癇灶，其病理異常不會(huì)影響到對(duì)側(cè)。若將異常癲癇致癇灶切除可治愈癲癇，為顳葉癲癇手術(shù)效果佳提供了理論依據(jù)，這與文獻(xiàn)報(bào)道相符［6，7］。

以往研究發(fā)現(xiàn)，外傷性腦損害(Traumatic brain damage，TBD)后紅細(xì)胞外滲、溶解和含鐵血黃素沉積于神經(jīng)纖維網(wǎng)內(nèi)，與癲癇發(fā)生有直接聯(lián)系，是人類外傷后的顯著特征。此外只要皮質(zhì)組織內(nèi)存在血液，就易引起癲癇的發(fā)生。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也提示，鐵具有致癲癇作用，這種致癇作用與其氧化還原特性有關(guān)。由此表明，以鐵離子致癲癇動(dòng)物模型將更接近腦出血臨床過(guò)程［8～10］，這與此項(xiàng)研究相符。

4 結(jié)論

鐵模型優(yōu)點(diǎn)有:(1)接近人類腦外傷后出血的臨床與病理改變;(2)成功率高，穩(wěn)定可靠;(3)潛伏期短，便于觀察和干預(yù)性研究。其中額葉皮層運(yùn)動(dòng)區(qū)注射鐵離子相比于鐵離子導(dǎo)入蛛網(wǎng)膜下腔、鐵離子杏仁體注射更為適合癲癇基礎(chǔ)研究和藥物研究。

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Comparative Study of epileptic animal models induced by different site

DU Peng，MU Yi－ti，LUAN Xin－ping，et al.(Department of Neurosurgery，The Second Affiliated Hospital，Xinjiang Medical University，Urumqi830063，China)

ObjectiveTo explore the different position induced posttraumatic epilepsy animal model stability and reliability.Method50 healthy adult male rats were randomly divided into 5 groups:SDA，SDB，SDC，SDD，SDE，10，SDA，SDB as the control group，SDC，SDD，SDE as epileptic model group，were prepared by different methods after successful epilepsy model was lighted respectively.Behavior，electroencephalogram，and histopathological observation of three aspects，data collection，statistical analysis were performed.ResultsThe study indicates that the SDC，SDD，SDE kindled epilepsy animal model.SDD lighted animal model appeared early，short duration，was not suitable as a human epilepsy foundation research;The difference of tissue pathology，SDA and SDB comparison was not statistically significantP＞0.05，exclusion experiment interference resulting in hippocampal CA1neurons cell loss;SDC，SDD，SDE decreased the CA1pyramidal cell number，compared with the control groupP＜0.01，the differences was significant compared with the contralateral，P＜0.01，the comparison of the three groups of ipsilateral has no significance.ConclusionPrefrontal cortex motor area injection of iron ion has the advantages of simple operation，high success rate，good reliability，compared to the other two，is more suitable for traumatic epilepsy in basic research and drug research.

Iron ion;Traumatic epilepsy;Animal model

R742.1

A

1003－2754(2013)06－0542－03

2013－04－14;

2013－05－30

新疆醫(yī)科大學(xué)創(chuàng)新基金(XJC201143)

(新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，新疆 烏魯木齊830063)

木依提，E－mail:13699994376@163.com