李 楠， 盧亞婷， 宋娟娜， 王 樸

(陜西科技大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西 西安 710021)

0 引言

薏苡仁是禾本科植物薏苡的干燥成熟種仁.具有健脾、補(bǔ)肺、清熱、利濕的功效, 《本草綱目》中稱其乃上品養(yǎng)心藥.其中薏苡仁油具有抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，增強(qiáng)肌體免疫，保護(hù)因化療引起的白血球減少的功效，其營(yíng)養(yǎng)保健功能已為人所公認(rèn)[1]，浙江康萊特藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的抗癌藥物康萊特注射液以薏苡仁油為主要原料，已在臨床中廣泛應(yīng)用[2,3].

目前文獻(xiàn)報(bào)道的關(guān)于薏苡仁油的提取方法基本上是采用有機(jī)溶劑回流提取法[4-6]，但一般都存在著提取步驟多、操作復(fù)雜、污染環(huán)境、產(chǎn)品質(zhì)量難以保證等問(wèn)題.超聲波具有熱效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)和空化效應(yīng)[7,8]，利用超聲波可以強(qiáng)化溶劑提取過(guò)程，縮短提取時(shí)間，減少溶劑用量，提高提取得率.本實(shí)驗(yàn)采用超聲強(qiáng)化提取薏苡仁油，并對(duì)影響因素進(jìn)行了研究，確定最佳提取條件.

現(xiàn)代藥理研究表明薏苡仁中的具抗腫瘤的活性成分為甘油三酯類組分，其中甘油三油酸酯含量較高且性質(zhì)穩(wěn)定，為更好地控制抗腫瘤藥物薏苡仁原料的質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)建立了薏苡仁中甘油三酯類主要成分甘油三油酸酯的含量測(cè)定方法，用于控制原料的質(zhì)量.提取方法簡(jiǎn)單，含量測(cè)定方法準(zhǔn)確、可靠、重復(fù)性好，可作為市場(chǎng)上薏苡仁藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)手段.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Waters高效液相色譜儀，包括1525型二元梯度色譜泵、2420型蒸發(fā)光散射檢測(cè)器、Empower色譜工作站(美國(guó)Waters公司).超聲波清洗器(KQ-250DE型)，江蘇省昆山市超聲儀器有限公司.精密電子天平(萬(wàn)分之一)，上海精密儀器有限公司.

乙腈、二氯甲烷均為色譜純.乙醇、正己烷、石油醚、氯仿、丙酮均為分析純.

甘油三油酸酯對(duì)照品(批號(hào)111692，標(biāo)示純度為99%以上，上海時(shí)代生物科技有限公司)

12批不同來(lái)源薏苡仁(S1重慶、S2福建、S3廣東、S4廣西、S5貴州、S6河北、S7遼寧、S8陜西、S9山東、S10山西、S11四川、S12浙江，均為市售品).

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 超聲提取法

稱取40～60目薏苡仁粉適量，加入一定量提取溶劑，置于超聲儀內(nèi)超聲提取，分別考察提取溶劑、提取溫度、材料粒徑、提取時(shí)間等因素對(duì)薏苡仁油脂提取率的影響，其他具體實(shí)驗(yàn)參數(shù)為：提取時(shí)間30 min，料液比1∶10，提取溫度40 ℃，超聲頻率與功率為25 kHz和300 W[9].超聲完畢，過(guò)濾，濾液蒸干，用適量丙酮溶解轉(zhuǎn)移至已稱質(zhì)量的干燥瓶中，自然揮干丙酮，精密稱定質(zhì)量并計(jì)算油脂的得率.

1.2.2 HPLC法測(cè)定甘油三油酸酯的含量

(1)色譜條件

Diamonsil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5μm)；流動(dòng)相為乙腈-二氯甲烷(60∶40)；流速為1.0 mL/min；2420蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，漂移管溫度70 ℃，氮?dú)鈮毫?5 psi，霧化器溫度35 ℃，增益為2[10].

(2)供試品溶液的制備

精密稱定薏苡仁粉0.6 g(大于80目)，加入丙酮50 mL，稱重，浸泡2 h，超聲40 min，超聲溫度為50 ℃，取出，放冷，用丙酮補(bǔ)足重量，搖勻，靜置，用0.45μm的微孔濾膜過(guò)濾，即得.

(3)對(duì)照品溶液的制備

精密稱取甘油三油酸酯對(duì)照品適量， 加丙酮制成0.15 mg/mL的溶液，即得.

2 結(jié)果與討論

2.1 超聲提取條件的確定

2.1.1 超聲提取溶劑的確定

稱取40～60目薏苡仁粉5份，每份10 g，分別加入95%乙醇、正己烷、石油醚、氯仿、 丙酮為提取溶劑，通過(guò)比較這些溶劑的超聲提取效果，確定超聲提取薏苡仁油的溶劑.具體的實(shí)驗(yàn)參數(shù)同1.2.1，各溶劑提油率分別為2.78%、2.96%、4.33%、4.60%、5.60%，丙酮的提油率明顯高于其他溶劑，故以丙酮作溶劑為宜.

2.1.2 超聲提取溫度的確定

以丙酮為提取溶劑，分別在30 ℃、40 ℃、及50 ℃、60 ℃進(jìn)行超聲提取實(shí)驗(yàn)，其他實(shí)驗(yàn)參數(shù)同1.2.1，考察溫度的變化對(duì)超聲提取的影響.由圖1可看出溫度對(duì)薏苡仁油提取率具有一定的影響，隨著提取溫度的升高，提取速率增大，油提取率有一定程度的提高，在30 ℃～60 ℃的溫度范圍內(nèi)，50 ℃、60 ℃時(shí)薏苡仁油的提取率比較高，相差不大，選擇50 ℃為最佳提取溫度.

圖1 超聲提取溫度對(duì)提取率的影響

2.1.3 薏苡仁粒徑的確定

以丙酮為提取溶劑，分別采用粒徑為20～40、40～60、60～80目以及大于80目的薏苡仁進(jìn)行超聲提取試驗(yàn)，超聲提取溫度為50℃，其他實(shí)驗(yàn)參數(shù)同1.2.1，從而考察薏苡仁粒徑的變化對(duì)超聲提取的影響.實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2，表明粒徑對(duì)超聲提取薏苡仁油的影響很明顯，隨著粒徑的增小，提取率有明顯的提高.最終確定薏苡仁粉碎至大于80目的粒徑.

圖2 原料粒徑對(duì)提取率的影響

為了更快更完全地浸出有效成分，在薏苡仁預(yù)處理時(shí),必須盡量破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使薏苡仁粒徑盡可能小，盡量使薏苡仁油成為游離狀態(tài)，同時(shí)薏苡仁應(yīng)該具有必要的機(jī)械結(jié)構(gòu)性能，以保證在粒子和粒子內(nèi)部之間良好的溶劑滲透.

2.1.4 超聲提取時(shí)間的確定

薏苡仁粒徑為40～60目，超聲提取溫度為50 ℃，其他實(shí)驗(yàn)參數(shù)同1.2.1，提取時(shí)間分別為10、20、30、40、50 min，通過(guò)薏苡仁油提取率的變化考察超聲提取時(shí)間的影響.圖3為超聲提取時(shí)間對(duì)提取率的影響，表明隨著超聲提取時(shí)間從10 min增加到40 min，提取率隨之增加；當(dāng)提取時(shí)間超過(guò)40 min時(shí)，隨著超聲提取時(shí)間的延長(zhǎng)，提取達(dá)到平衡后，薏苡仁油提取率基本保持不變.最終確定超聲提取時(shí)間為40 min.

圖3 超聲提取時(shí)間對(duì)提取率的影響

2.2 HPLC法含量測(cè)定結(jié)果

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)加入法定位甘油三油酸酯

精密吸取一定量標(biāo)準(zhǔn)品溶液加入S8供試品溶液中，比較加入前后的樣品色譜圖，峰面積明顯增大的峰即為甘油三油酸酯峰.由圖4可知，在保留時(shí)間為23 min左右的色譜峰明顯增高，峰面積明顯變大，由此確定甘油三油酸酯的峰為圖中23 min左右時(shí)所出色譜峰.該色譜峰左右對(duì)稱，峰形良好，附近無(wú)其他色譜峰干擾，可以用于該成分的準(zhǔn)確定量.

圖4 添加與未添加甘油三油酸酯標(biāo)準(zhǔn)品的薏苡仁樣品HPLC圖A. 添加甘油三油酸酯標(biāo)準(zhǔn)品的薏苡仁樣品；B. 薏苡仁樣品； 1. 甘油三油酸酯

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密量取對(duì)照品溶液2，5，10，15，20μL分別注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積，以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線.通過(guò)最小二乘法得到回歸方程為Y=6991.2x-491.02，線性相關(guān)系數(shù)r=0.998 3，結(jié)果顯示進(jìn)樣量在0.241～2.416μg范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系[11].

2.2.3 精密度試驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液20μL連續(xù)進(jìn)樣3次，測(cè)定峰面積值和保留時(shí)間，峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.15%，保留時(shí)間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.65%.

2.2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

取S8樣品，按1.2.2項(xiàng)下方法制備3份供試品溶液，并按該項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定峰面積值和保留時(shí)間，峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.23%，保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.10%.

2.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一份供試品溶液，在制備好后每隔一定時(shí)間(0 h，4 h，8 h，16 h，32 h)按上述色譜條件進(jìn)樣分析，考察色譜峰的峰面積和保留時(shí)間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于3.0%，確定32 h內(nèi)基本穩(wěn)定[12].

2.2.6 加樣回收試驗(yàn)

精密稱取3份已知含量樣品粉末0.3 g(精確至0.000 1)，分別精密加入甘油三油酸酯對(duì)照品15 mL，使加入的對(duì)照品甘油三油酸酯的量與薏苡仁粉末中的該物質(zhì)含量基本相同，按供試品溶液方法制備，測(cè)定峰面積并計(jì)算含量.平均回收率為101.42%，RSD=2.6%.

2.2.7 樣品的含量測(cè)定

按1.2.2項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備不同來(lái)源的12批薏苡仁供試品溶液，按該項(xiàng)下色譜條件分別注入高效液相色譜儀分析，12批不同來(lái)源薏苡仁供試品溶液色譜疊加圖見(jiàn)圖5，各批薏苡仁中甘油三油酸酯的含量結(jié)果見(jiàn)表1.12批不同來(lái)源的薏苡仁中甘油三油酸酯含量有一些差異，多數(shù)樣品中甘油三油酸酯的含量均超過(guò)0.8%，其中購(gòu)自廣東藥材市場(chǎng)和四川瀘州百姓藥房的薏苡仁含量最高達(dá)1.2%，其外觀質(zhì)硬有光澤，色白，顆粒飽滿，只有購(gòu)自沈陽(yáng)壽康大藥房、太原仁和大藥房的樣品含量較低，分別為0.686%、0.636%，色澤不太白，可能儲(chǔ)存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，質(zhì)量較差.

圖5 12批不同來(lái)源薏苡仁供試品HPLC疊加圖

編號(hào)來(lái)源平均含量/%相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差/%(n=3)S1重慶海華醫(yī)藥超市0.8320.5S2福建江南益壽堂0.8540.8S3廣東藥材市場(chǎng)1.2601.3S4廣西佳禾大藥房0.8930.6S5貴州老百姓大藥房0.7501.0S6河北祁?yuàn)W中藥飲片有限公司0.8450.9S7沈陽(yáng)壽康大藥房0.6861.4S8西安老百姓大藥房0.8731.1S9濟(jì)南魯能超市0.9320.9S10太原仁和大藥房0.6360.6S11四川瀘州百姓藥房1.2892.1S12浙江慈福堂醫(yī)藥0.8281.2

2.3 討論

2.3.1 提取方法的確定

大多數(shù)植物油脂的提取屬于液-固萃取過(guò)程，萃取效果主要由原料粒度和溶劑的性質(zhì)決定.在原料粒度固定的情況下，在不同提取方法中由于提取過(guò)程中傳質(zhì)和傳熱機(jī)理的不同，其提取效率也有很大的差別.實(shí)驗(yàn)前期比較了超聲、回流和索氏提取三種方法應(yīng)用不同溶劑對(duì)薏苡仁油提取率的影響，結(jié)果以丙酮超聲提取既方便且提取效率高.原因可能是丙酮極性較大，介電常數(shù)也較大，對(duì)能量吸收作用好，在超聲波作用下，分子運(yùn)動(dòng)頻率和速度都有所增強(qiáng)，因而其穿透能力也相應(yīng)增強(qiáng)，能有效提高有效成分的溶出速度而有利于提取.

2.3.2 流動(dòng)相的選擇

采用HPLC法對(duì)甘油三油酸酯含量測(cè)定方法的研究中，在色譜條件優(yōu)化時(shí)曾試用流動(dòng)相為乙腈-二氯甲烷(65∶35)的比例及流速0.8 mL/min，均因分離效果不好或費(fèi)時(shí)而沒(méi)有采用，最終綜合考慮基線噪音、出峰時(shí)間和分離效果等因素，調(diào)整流動(dòng)相比例為乙腈-二氯甲烷(60∶40)，流速為1 mL/min[13].

2.3.3 檢測(cè)器的確定

由于甘油三酯類成分在紫外區(qū)基本無(wú)吸收，采用紫外檢測(cè)器需對(duì)樣品進(jìn)行衍生化處理[14]，存在測(cè)試周期較長(zhǎng)、操作成本較高和前處理過(guò)程繁雜等缺點(diǎn)，采用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器提高了靈敏度，對(duì)樣品無(wú)紫外吸收的要求，在本試驗(yàn)最優(yōu)色譜條件及檢測(cè)條件下各色譜峰分離效果良好.

3 結(jié)論

采用丙酮超聲強(qiáng)化提取薏苡仁油，方法簡(jiǎn)單、快速、提取效率高.同時(shí)采用HPLC-ELSD法測(cè)定甘油三油酸酯的含量，在最優(yōu)色譜條件下，甘油三油酸酯的線性范圍為0.241～2.410μg，相關(guān)系數(shù)為0.996 3.該含量測(cè)定方法操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、重現(xiàn)性好，樣品測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可以用于評(píng)價(jià)不同來(lái)源中藥薏苡仁及其他含有甘油三酯類成分藥材的內(nèi)在質(zhì)量.

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