楊 耀 孫 翔 朱志軍 張迎軍

1.解放軍第一一七醫(yī)院心血管中心，浙江杭州 310000；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院心內(nèi)科，內(nèi)蒙古呼和浩特 010058

基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）是對細胞外基質(zhì)成分（extracellular matrix，EMC）有特異降解作用的鋅依賴蛋白水解酶，在人體內(nèi)主要作用是參與細胞外基質(zhì)成分的降解、重構(gòu)、炎性反應等各種生理及病理過程[1-3]?；|(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）又稱為明膠酶B，是基質(zhì)金屬蛋白酶家族之一，具有降解血管壁細胞外基質(zhì)中成分的功能，影響動脈斑塊的穩(wěn)定性，與冠心病的發(fā)病具有一定關聯(lián)性，目前已發(fā)現(xiàn)MMP-9基因中存在著多個序列變異，其中，啟動子序列-1562C/T多態(tài)位點最受到關注。-1562C/T多態(tài)位點與冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。╟oronary disease，CAD）易感性關系的研究結(jié)果眾說紛紜[4]。為此，本研究通過采用限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應 （PCRRFLP），了解MMP-9-1562C/T基因多態(tài)性的分布，計算各SNP位點的等位基因頻率、基因型頻率，從而分析MMP-9-1562C/T基因多態(tài)性與CAD易感性的相關性，現(xiàn)將結(jié)果報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

采用隨機數(shù)字表法抽取2010年1月～2012年10月于解放軍第一一七醫(yī)院（以下簡稱“我院”）心內(nèi)科就診的冠心病患者240例作為病例組，其中，穩(wěn)定型心絞痛（atable angina，SA）84 例，不穩(wěn)定型心絞痛（unstable angina，UA）90例，急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）66 例。病例的診斷及分型參照1997年WHO的診斷標準。同時隨機抽取同期至我院其他科室就診的患者200例作為對照組，患者冠狀動脈造影結(jié)果均正常，未患有心臟相關疾病，無冠心病史。病例及對照組均排除患有惡性腫瘤、免疫系統(tǒng)疾病、感染性疾病、外周血管疾病、嚴重肝腎功能不全及使用免疫抑制劑者。兩組平均年齡、性別構(gòu)成等一般情況比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），具有可比性。見表1。所有入組調(diào)查對象間均無血緣關系，并且均簽署知情同意書。所有實驗操作規(guī)范及樣本采集方式均經(jīng)我院倫理委員會倫理會議通過。

表1 調(diào)查對象一般資料比較（ ±s）

表1 調(diào)查對象一般資料比較（ ±s）

注：1 mm Hg=0.133 kPa；BMI：體重指數(shù)；SBP：收縮壓；DBP：舒張壓；Glu：血糖；TG：三酰甘油；TC：總膽固醇；HDL-C：高密度脂蛋白膽固醇；LDLC：低密度脂蛋白膽固醇

病例組對照組t/χ2值P值61.6±11.7 61.9±10.6 1.285＞0.05 159/81 126/74 1.006＞0.05 24.0±3.0 23.1±2.5 1.320＞0.05 129.7±15.3 127.6±14.4 0.745＞0.05 80.9±11.7 78.5±8.8 0.584＞0.05 4.9±1.4 4.9±1.3 0.412＞0.05 1.7±0.6 1.6±0.6 0.303＞0.05組別 年齡（歲）性別（例，男/女）BMI（kg/m2）SBP（mm Hg）DBP（mm Hg）Glu（mmol/L）TG（mmol/L）4.7±1.7 4.7±1.2 0.314＞0.05 1.0±0.2 1.0±0.3 0.257＞0.05 3.1±1.1 3.2±0.4 0.679＞0.05 TC（mmol/L）HDL-C（mmol/L）LDL-C（mmol/L）

1.2 方法

1.2.1 試劑和儀器 SphⅠ限制性內(nèi)切酶由伊普瑞斯科技有限公司提供，紫外分光光度計、PCR儀由上海醫(yī)科大學儀器廠提供。

1.2.2 資料收集及常規(guī)檢測 收集病例組及對照組的一般人口學特征（年齡、性別）、家族史、冠心病史、冠心病危險因素暴露情況（高血壓、糖尿病、高脂血癥等），對調(diào)查對象進行血壓、血糖、血脂等常規(guī)檢測。

1.2.3 PCR檢測 采用PCR-RFLR法對調(diào)查對象血液樣本進行基因分型，并對比病例組及對照組之間的差異。人類MMP-9 基因（ID：4318）位于 20q11.2～q13.1，長 7654 bp，mRNA長2387 bp，編碼 13個外顯子，該基因共 155個單核苷酸多態(tài)性 （SNPs），本次研究選擇位于啟動子區(qū)的-1562C/T作為研究位點。采用鹽析法提取調(diào)查對象外周血基因組DNA，對提取的DNA進行鑒定，若DNA的OD260/OD280＞1.7，說明DNA純度合格，否則需從新提取。將鑒定合格的DNA進行定量，根據(jù)測定原液的DNA濃度加入TE液，將DNA的終濃度稀釋為20 ng/μL。建立PCR反應體系 10 μL及酶切體系15 μL，PCR的反應條件如下：95°C 5 min；95°C 30 s，69°C 30 s，72°C 40 s，35 個循環(huán)；72°C 7 min， 產(chǎn)物為 435 bp。 引物序列為 （U）5'-CCTGCTA CAATATACCCCC-3'， （L）5'-CTTCTCTAGCCTCAGGGCATC-3'。內(nèi)切酶酶切片段長度C等位基因為435 bp，T等位基因為247 bp+188 bp。當-1562C/T多態(tài)性為C等位基因時，PCR產(chǎn)物不能被SphⅠ內(nèi)切酶識別，反應后MMP-9-1562C/T為CC純合子基因型的個體片段長度為僅一個片段，為435 bp；MMP-9-1562C/T多態(tài)性為T等位基因時，PCR產(chǎn)物可被SphⅠ識別，因此，MMP-9-1562C/T為TT純合子基因型個體經(jīng)限制性內(nèi)切酶SphⅠ酶切后產(chǎn)生兩個片段，分別為247 bp和188 bp；MMP-9-1562C/T為CT雜合子基因型個體的PCR產(chǎn)物經(jīng)SphⅠ酶切后產(chǎn)生3個片段，分別為435 bp、247 bp和188 bp。采用瓊脂糖凝膠電泳法鑒定樣本的基因型，凝膠成像結(jié)果膠片拍照保存并由兩名醫(yī)師獨立判斷結(jié)果，核實后錄入數(shù)據(jù)庫。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 14.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

病例組 MMP-9-1562C/T基因型為 CC、CT、TT的頻率分別為 0.78、0.20、0.02， 對照組分別為 0.81、0.18、0.01，兩組基因型的分布差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.59，P＞0.05）；病例組與對照組CC/CT+TT的OR值為0.83，差異無統(tǒng)計學意義（OR 95%CI：0.51～1.36，P>0.05），見表 2。 病例組與對照組C/T等位基因OR值為0.83，差異也無統(tǒng)計學意義（OR 95%CI：0.44～1.55，P ＞ 0.05），見表 3。 提示 MMP-9-1562C/T基因型及等位基因與冠心病的發(fā)生無關聯(lián)性。

表2 兩組MMP-9-1562C/T基因型頻率情況

表3 兩組MMP-9-1562C/T等位基因頻率情況

3 討論

目前越來越多的研究證實MMPs啟動子區(qū)域的SNPs影響著MMPs的轉(zhuǎn)錄活動，MMPs活性增強時[5-7]，會引起動脈中膠原成分的減少，使冠狀動脈中斑塊結(jié)構(gòu)脆化，纖維帽易于破裂，從而引起冠心病的發(fā)生。MMP-9是MMPs中重要的一員，能夠廣泛降解明膠、膠原及彈性蛋白。有動物實驗建立了敲除MMP-9基因的小鼠模型[8]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，敲除模型小鼠比野生小鼠更不容易發(fā)生動脈粥樣硬化病變。因此，認為高度表達的MMP-9基因與冠脈粥樣硬化、冠狀動脈斑塊不穩(wěn)定、支架內(nèi)再狹窄等有關。人類MMP-9基因（ID：4318）位于 20q11.2～q13.1，共 155 個 SNPs，其中，位于啟動子區(qū)的-1562C/T與冠心病發(fā)生的關聯(lián)性較受關注。既往研究認為，-1562C/T多態(tài)性位點的堿基突變能夠在轉(zhuǎn)錄水平影響基因表達，從而影響酶蛋白合成數(shù)量。當突變位點位于該基因與轉(zhuǎn)錄抑制蛋白結(jié)合的區(qū)域內(nèi)，C堿基突變?yōu)門堿基后，區(qū)域的構(gòu)型即可發(fā)生變化，導致基因與轉(zhuǎn)錄抑制蛋白的結(jié)合力下降，轉(zhuǎn)錄抑制的作用減弱，啟動子活性增強，基因轉(zhuǎn)錄增強，MMP-9表達量增加，MMP-9對細胞外基質(zhì)的降解增加，導致冠狀動脈破壞增加。

然而，目前關于MMP-9-1562C/T與冠心病發(fā)生關聯(lián)性的報道結(jié)論不一致[9-12]。有文獻證實了，-1562C＞T基因多態(tài)性與冠狀動脈狹窄程度具有相關性，冠心病患者中CT和TT兩種基因型的分布頻率明顯高于冠狀動脈造影正常者；經(jīng)過Logistic回歸分析后發(fā)現(xiàn)，T等位基因攜帶者發(fā)生冠心病的風險比未攜帶該等位基因者高1.5倍[9-10]。而Wang等[11]報道，-1562C/T多態(tài)性與冠狀動脈粥樣硬化程度無關。Haberbosch等[12]通過設計病例對照研究在德國人群中研究的結(jié)果認為，MMP-9基因-1562C＞T多態(tài)性與冠心病的發(fā)病及心肌梗死的發(fā)生無相關。本次研究結(jié)果也顯示，MMP-有1只于術后第9天死于肺炎。Fandrich等[7]也發(fā)現(xiàn)，有2只實驗動物因分泌的黏液積聚在移植物的遠端而致肺水腫和肺不張。而Letang等[5]應用紗布擦去小腸的黏膜層后未發(fā)現(xiàn)大量黏液分泌的現(xiàn)象。本實驗結(jié)果也支持該結(jié)果。A組（不去空腸黏膜組）發(fā)現(xiàn)氣管造瘺口術后 1周內(nèi)有較多腸液流出，有2只Beagle犬在術后第2周因肺部感染死亡，而B、C組（部分及全部去空腸黏膜組）術后1周內(nèi)則有較少腸液流出，咳嗽較輕。然而，過度搔刮全部去除黏膜層，亦會造成術后肉芽生長，上皮生長延遲，因缺乏上皮的覆蓋，會減弱動物抵抗病原體感染的能力。本實驗中全部去除黏膜層組有1只Beagle犬在術后第50天因移植空腸感染而死亡，估計與上述因素有關。

化生是機體的一種組織因細胞生活環(huán)境改變或理化因素刺激，在形態(tài)和機能上變?yōu)榱硪环N組織的過程，是機體的一種適應現(xiàn)象。正常氣管的內(nèi)壁為假復層纖毛柱狀上皮覆蓋，黏液-纖毛轉(zhuǎn)用系統(tǒng)在氣道防御機制中占有重要地位，是氣道的第一道防線。而空腸內(nèi)腔為單層柱狀上皮，有大量小腸腺和絨毛結(jié)構(gòu)，不存在黏液-纖毛轉(zhuǎn)用系統(tǒng)。因此，移植空腸的黏膜上皮完全化生為假復層纖毛柱狀上皮，并具有正常的纖毛功能，這是最為理想的氣管重建。Letang等[5]擦除了空腸黏膜行腸代氣管重建的實驗中發(fā)現(xiàn)，術后在吻合口附近的空腸腔內(nèi)有少量的鱗狀上皮出現(xiàn)，術后3周有近20%的空腸表面被鱗狀上皮覆蓋，認為這些鱗狀上皮可能起源于附近的正常氣管的上皮。Nakayama[6]的研究也觀察到類似的現(xiàn)象。本研究在空腸重建氣管缺損動物模型的腸膜黏組織變化的研究過程中，也觀察到了這一現(xiàn)象：A、B、C三組均在術后6個月，在移植空腸表面見假復層纖毛柱狀上皮覆蓋，B、C組較A組 早1個月出現(xiàn)假復層纖毛柱狀上皮。以上實驗結(jié)果表明，去部分空腸黏膜能加速移植空腸的上皮化，加速纖毛柱狀上皮的化生，但對空腸黏膜的最終化生結(jié)果沒有影響。

本組實驗結(jié)果顯示，去除部分腸黏膜能有效減少分泌細胞的數(shù)量，從而減少移植空腸的腸液分泌，減少分泌物對呼吸系統(tǒng)的影響；去部分腸黏膜能加速空腸黏膜萎縮變薄、絨毛變短脫落[8-9]，促進鱗狀上皮化生，減少因缺乏上皮的覆蓋，導致病原體的感染，從而促進氣管愈合。據(jù)此，去部分腸黏膜游離空腸重建氣管動物模型是一較為理想的游離空腸重建氣管動物模型，其將有望解決空腸移植術后腺體分泌及上皮覆蓋這兩大難題，使游離空腸重建氣管技術更接近理想，為游離空腸重建氣管應用于臨床提供良好的實驗依據(jù)。

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