李曉靜 王新木 董 研* 茍中入

1(浙江大學醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院口腔修復科，杭州 310009)

2(杭州市第一人民醫(yī)院口腔科，杭州 310006)

3(浙江大學浙江加州國際納米技術研究院，杭州 310029)

引言

骨組織工程與再生醫(yī)學，是指體外構建人工骨組織或者利用生物裝置、植入生物材料來刺激骨原細胞或干細胞分化，維持和促進成骨細胞增殖，以重建缺損的骨組織。骨組織工程與再生醫(yī)學依賴于多個因素，主要包括細胞、生長因子、生物支架和穩(wěn)定的機械環(huán)境［1］。自體骨和同種異體骨移植可滿足以上要求，但兩者均存在不足之處:自體骨骨量極為有限，并且增加了手術部位和傷口愈合期并發(fā)癥［2］;同種異體骨移植可能引發(fā)慢性炎癥，甚至產(chǎn)生免疫排斥反應。因此，骨移植修復術的不足促進了人工骨修復生物材料的發(fā)展。譬如，已對羥基磷灰石 (HA)、A-W玻璃陶瓷、殼聚糖、膠原以及復合材料等已在骨損傷修復中的應用開展了廣泛研究［3－4］。

甲殼素，又名甲殼質(zhì)、幾丁質(zhì)，化學名稱為聚N-乙酰葡萄糖胺，主要存在于甲殼類動物蝦、蟹、昆蟲的外殼及高等植物的細胞壁中，是世界上第二豐富的天然生物聚合物［5－6］。殼聚糖是甲殼素脫乙酰基的衍生物，又名幾丁糖，具有良好的生物相容性、生物可降解性。大量研究已證實，殼聚糖還具有抗菌［7］、止血、促進傷口愈合［8］、促進骨再生［9］等優(yōu)良的生物學效應，也可與膠原、HA、二氧化硅等復合制備成為薄膜、海綿、可注射型水凝膠形式，應用于骨組織修復領域［10－11］。

但是，采用常規(guī)方法制備的殼聚糖多孔支架的不足之處在于材料的綜合力學性能差，對成骨細胞生長刺激效應以及促進成骨細胞分化相關生長因子表達的效應低［12］。為了彌補這些缺陷，納米材料逐漸應用于骨損傷修復領域。納米材料指某一維度具有1～100 nm尺寸的材料，具有高表面積體積比，在骨損傷修復領域具有廣泛的應用前景［13］。基于目前殼聚糖納米材料在骨損傷修復中的廣泛研究及取得的相關成果，下面就殼聚糖以及所涉及的納米纖維支架、納米粒子和納米復合支架材料的制備方法以及在骨組織工程與再生醫(yī)學領域的研究進行綜述。

1 基于殼聚糖的納米材料的制備方法

1.1 殼聚糖納米纖維

殼聚糖納米纖維的制備方法包括靜電紡絲法［14］、自組裝法［15］和熱誘導相分離法［16］等，其中靜電紡絲法的應用較多。靜電紡絲法的基本原理是:帶電的聚合物溶液或熔體在外加高壓靜電場力作用下形成噴射流，經(jīng)溶劑蒸發(fā)或熔體冷卻干燥后形成納米纖維。影響電紡射流穩(wěn)定性和納米纖維形態(tài)的因素較多，主要包括聚合物的性質(zhì)(如溶液濃度、黏度、表面張力、導電性等)、操作參數(shù)(如電壓、接收距離、溶液推射速度)以及外部環(huán)境(如溫度、濕度等)［17］。

靜電紡絲技術制備的殼聚糖纖維直徑通常在數(shù)十納米至數(shù)微米之間，無規(guī)則沉積后形成無紡布狀的纖維膜，其顯著特征是納米纖維支架具有極高的表面積體積比和高的孔隙率，形態(tài)類似于天然細胞外基質(zhì)的纖維結構［18］。但靜電紡絲技術制備的膜通常是二維(2D)的納米纖維膜，其高孔隙率利于蛋白吸收及細胞黏附，但其孔徑較小，使得細胞只能在其表面生長而不能伸入其內(nèi)部。為了得到大孔徑的三維(3D)支架，有學者采用NaCl作為致孔劑，使納米纖維膜的孔徑及孔隙率均有所提高［19］，或采用改變接收裝置法［20］、超聲法［21］與其他支架復合［22］等方法。

自組裝方法制備的納米纖維較細小，直徑平均200 nm，長度僅為幾微米。納米纖維直徑受殼聚糖分子量、殼聚糖濃度、溶液pH和溫度等影響［23］。

1.2 殼聚糖納米粒子

殼聚糖納米粒子的制備方法有離子交聯(lián)法、聚電解質(zhì)復合法、乳化交聯(lián)法、乳化液滴聚集法、乳化溶劑擴散法、反向微乳法等［24］。離子交聯(lián)法中最常使用的離子交聯(lián)劑是三聚磷酸鈉 (TPP)，多用作藥物緩釋載體的制備，由于其反應條件簡單溫和，成為目前殼聚糖納米粒子制備研究中最常使用的方法。在制備體系中，殼聚糖分子量及濃度、殼聚糖/TPP質(zhì)量比以及溶液的pH值等均會影響納米粒的粒徑及表面電荷。聚電解質(zhì)復合法的反應原理同離子交聯(lián)法的反應原理，殼聚糖與大分子聚陰離子(如羧甲基羥乙基纖維素、肝素、胰島素和DNA等)可聚合為納米粒子，作為生物大分子的運輸載體。

乳化交聯(lián)法、乳化液滴聚集法、乳化溶劑擴散法、反向微乳法等通常在有機溶劑體系中使用，或制備程序繁瑣，所以用其制備納米顆粒作為生物材料受到一定限制［25］。

1.3 殼聚糖納米復合材料

磷酸鈣是一類包括天然骨組織細胞外無機礦物基質(zhì)主要成分在內(nèi)的無機化合物，其最穩(wěn)定的一種形式是HA，骨骼中的無機礦物為碳酸化羥基磷灰石(CHA)。人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，不少磷酸鈣均可作為骨移植材料植入骨缺損區(qū)，逐漸被新形成的骨組織所取代，具有良好的骨引導性。碳納米管 (CNTs)是碳的同素異形體，呈圓柱形納米結構，長度與直徑比可達28000000∶1，結構與化學性能穩(wěn)定，其最顯著的特征是具有較高的機械性能。已有研究證明，將納米羥基磷灰石 (nHA)、納米磷酸鈣、CNTs與殼聚糖基質(zhì)混合后，采用冷凍干燥、原位合成、沉淀法等方法，可制備成多孔的殼聚糖復合納米材料支架［2］。另外，人們也發(fā)現(xiàn)，nHA、CaO-P2O5-SiO2組成的生物活性無機納米粒子等與殼聚糖基質(zhì)混合，逐滴加入甘油磷酸酯二鈉鹽(GP)，持續(xù)攪拌后可制備成熱塑型的可注射型復合凝膠［26－27］，由于其具有微創(chuàng)可注射特性，因而在骨損傷修復中備受關注。

2 在骨組織工程及再生醫(yī)學中的研究

2.1 作為骨組織工程生物支架

在骨組織工程與再生醫(yī)學中，生物支架的性能至關重要。良好的生物相容性、可降解性、高孔隙率、具有一定的機械穩(wěn)定性和骨引導性等，是骨組織工程中生物支架所應滿足的基本要求［28］。殼聚糖生物支架具有極好的生物相容性，在體內(nèi)可被溶菌酶等降解為無毒的低聚糖，被人體吸收利用;生物支架具有大孔徑及高的孔隙率，可引導組織中的細胞在其表面及支架內(nèi)部黏附生長增殖，并利于血管形成及骨基質(zhì)礦化物的形成。但其機械強度相對較低，本身不具有骨誘導性，對細胞生物活性較低。隨著材料科學和生命科學的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)納米纖維支架和納米復合生物支架可以克服這些缺點。

2.1.1 殼聚糖納米纖維支架

Shin等采用靜電紡絲法制備了殼聚糖納米纖維膜，纖維直徑平均200 nm，孔徑大小平均5 μm，孔隙率80%，抗張強度達10 MPa［29］，高于目前臨床常用的引導骨再生膜Bio-Gide的抗張強度(約2.94 MPa)［30］。但也有學者的研究結果顯示，殼聚糖納米纖維膜的機械強度較低，殼聚糖含量為50%的殼聚糖膠原納米纖維膜抗張強度僅為1.5 MPa，且隨著殼聚糖含量增加，纖維膜的抗張強度降低［31］。剪切強度測試表明，交聯(lián)與未交聯(lián)的殼聚糖納米纖維膜均低于臨床常用的引導骨再生Bio-Mend膜［32］。可見，殼聚糖納米纖維膜的機械強度還亟待提高。

Datta等在N-亞甲基磷酸殼聚糖 (NMPC)納米纖維膜與NMPC凝膠支架上植入成骨樣細胞，第5 d時經(jīng)細胞染色熒光顯微鏡觀察:納米纖維膜上的細胞呈多角形，鋪展于支架表面，而凝膠支架上的細胞呈簇狀分布，且納米纖維膜上的細胞表現(xiàn)出更高的增殖率及功能活性［33］。由于納米纖維支架可模擬細胞外基質(zhì)膠原纖維，比表面積較大，利于細胞的偽足在材料表面黏附，可促進細胞進一步在支架表面生長增殖。

Zhao等將聚丙烯碳酸酯/殼聚糖納米纖維支架(PPC/CSNFs)、聚丙烯碳酸酯支架 (PPC)植入到兔股骨髁突直徑為6 mm、長為10 mm的骨缺損處，16周組織學觀察到:植入PPC/CSNFs支架組的缺損邊界消失，骨缺損區(qū)已完全被新生骨組織所取代，且比PPC支架組的新生骨量多，而空白對照組只有少量的再生骨，邊界仍清晰可見［16］。由此表明，殼聚糖納米纖維支架具有高表面體積比，利于組織中細胞的黏附及生長增殖，從而加速了骨再生修復。

2.1.2 殼聚糖納米復合材料支架

已有研究發(fā)現(xiàn)，納米磷酸鈣、nHA或CNTs與殼聚糖基質(zhì)混合制備的納米復合支架具有較高的機械性能，且隨著納米材料含量的增加，機械性能提高［34－36］，而且三者良好的骨引導性利于成骨細胞在支架表面及內(nèi)部的生長增殖。將成骨樣細胞植入到功能性多壁碳納米管/殼聚糖復合支架上體外培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)細胞可以大量黏附、增殖并向成骨細胞分化［37］。將nHA/殼聚糖海綿樣三維支架植入到大鼠顱頂骨直徑為6.5 mm的圓形骨缺損中，組織學觀察，在2周時骨缺損區(qū)邊緣及支架中心有新骨形成，在5周時植入支架的骨缺損區(qū)與空白對照相比已有明顯的新骨形成［38］。

由CaO-P2O5-SiO2三元氧化物組成的生物活性玻璃無機納米粒子及二氧化硅和氧化鋯納米粒子均可與殼聚糖基質(zhì)混合制備成納米復合凝膠或支架，復合材料在浸入與人體血漿離子濃度相似的模擬體液中14天后，掃描電鏡觀察到復合支架表面或孔內(nèi)均有致密的磷灰石晶體形成［27，39］。這說明，復合支架表面納米粒子及降解時游離出的無機納米粒子可促進骨樣礦物鹽在支架表面沉積。

2.2 作為生長因子的緩釋載體

生長因子是一類通過與特異的、高親和的細胞膜受體結合，調(diào)控細胞生長與其他細胞功能等多效應的多肽類物質(zhì)。骨誘導性生長因子包括骨形態(tài)形成蛋白 (BMP)、血管內(nèi)皮生長因子 (VEGF)、轉化生長因子 (TGF)、血小板源性生長因子等［12］，可在骨修復過程中促進成骨細胞增殖，抑制破骨細胞生長，從而誘導骨形成。殼聚糖納米粒子可作為骨誘導性生長因子的釋放載體，當植入骨缺損區(qū)后，釋放的生長因子高效調(diào)控成骨細胞的生長增殖，進而提高骨再生效率。

有學者采用離子交聯(lián)法制備了包載BMP-2的殼聚糖微球，平均直徑230 nm，微球分散性好。用殼聚糖微球浸提液來培養(yǎng)小鼠成纖維細胞，細胞生物相容性較好，無細胞毒性［40］。殼聚糖微球?qū)MP-2的包載率可達85%，體外研究釋放緩慢，釋放時間可持續(xù)30 d［41］。Hou制備的殼聚糖微球表面呈多孔結構，經(jīng)吸附rhBMP-2后復合到膠原海綿支架上，在兔橈骨15 mm節(jié)段性骨缺損處植入復合支架，12周后組織學觀察發(fā)現(xiàn)，吸附rhBMP-2的殼聚糖微粒復合支架組比rhBMP-2/膠原支架組有明顯的骨再生［42］，說明殼聚糖微球是rhBMP-2的有效載體，可保持其生物活性。

VEGF可促進血管的再生，利于骨損傷修復中血管網(wǎng)絡的建立。有學者將殼聚糖、硫酸葡聚糖和VEGF共混制備的包載VEGF的納米粒子和游離VEGF分別植入到聚丙交酯－乙交酯(PLGA)支架中，將兩種形式的支架植入鼠腹膜脂肪層，2周后采用免疫染色檢測內(nèi)皮細胞數(shù)量，采用自體熒光檢測紅細胞數(shù)量，結果顯示包載VEGF納米粒子組內(nèi)皮細胞和紅細胞數(shù)量比游離VEGF復合支架組要顯著增多，血管再生明顯［43］，表明殼聚糖納米粒子可作為VEGF的有效載體，在骨損傷修復中發(fā)揮其促進血管再生的作用。

2.3 作為外源基因的遞送載體

殼聚糖帶正電荷氨基可以和帶負電荷DNA分子通過聚電解質(zhì)復合法制備成納米粒子，作為外源基因的遞送載體，通過轉染到體內(nèi)細胞經(jīng)基因表達而發(fā)揮其生物性能，是骨再生醫(yī)學基因治療中的有效載體［44］。Nie制備了包載BMP-2質(zhì)粒DNA的殼聚糖納米粒子復合PLGA/HA支架，研究者將復合支架植入到鼠脛骨的骨缺損處，相比對照組表現(xiàn)出更高且持久的骨愈合能力［45］。實驗表明，殼聚糖納米粒子作為DNA的有效緩釋載體，可維持其轉染活性，并發(fā)揮其有效的生物學活性。

殼聚糖納米粒子對轉化生長因子 β1質(zhì)粒(pTGF-β1)包載率可達 (87.5 ±2.3)%，體外釋放實驗結果顯示，初期時釋放較快，之后釋放緩慢，并隨著時間延長釋放率逐漸增加，在90天時釋放40%左右。殼聚糖/pTGF-β1納米粒與裸pTGF-β1體外轉染軟骨細胞，在48 h后流式細胞儀檢測，兩組的轉染率分別為(7.18±1.52)%和(0.97±40.70)%，有顯著差異?？梢姡瑲ぞ厶羌{米?？沙浞职dpTGF-β1，具有良好的緩釋性能，且能成功轉染體外細胞［46］。

有研究發(fā)現(xiàn)，殼聚糖雖能包載DNA和RNA，并能避免核酸被核酸酶降解，但其水溶性小、轉染效率較低［46－47］。將殼聚糖化學改性，在烷基化殼聚糖和巰基殼聚糖包載DNA和RNA后，其轉染效率可有所提高。Yu等制備了BMP-4和VEGF121基因的重組質(zhì)粒，經(jīng)巰基烷機化殼聚糖和重組質(zhì)粒聚電解質(zhì)反應制備了納米粒子，復合明膠海綿后植入到兔橈骨長度15 mm的骨缺損處，結果顯示實驗組比明膠海綿組骨再生速度快且新生骨量較多［48］。究其原因，可能是改性的殼聚糖納米粒子增強了與細胞的黏附率、滲透率，使得基因轉染率提高。

此外，殼聚糖/聚丙烯酸納米纖維也可作為質(zhì)粒DNA的有效載體，已證實可成功轉染人類真皮成纖維細胞［23］。

3 問題及展望

通過回顧3種基于殼聚糖的納米材料在骨損傷修復與再生醫(yī)學中的研究，發(fā)現(xiàn)殼聚糖納米復合材料可提高殼聚糖支架的機械強度及對成骨細胞的生物活性;殼聚糖納米纖維支架在結構、形態(tài)上與天然膠原纖維相似，類似于天然骨細胞外基質(zhì)，其納米級尺寸、高孔隙率、高表面體積比有利于成骨細胞黏附增殖及功能分化，同時也可作為生物活性因子的遞送載體;殼聚糖納米粒子是生物活性因子、外源基因等的有效載體，通過包載具有誘導成骨性的生長因子及外源基因，可提高骨再生能力。然而，目前主要是對基于殼聚糖的納米材料的體外及動物體內(nèi)的研究，但有些問題尚需進一步研究，如其納米材料的體內(nèi)降解時間是否能滿足骨再生的需求，殼聚糖納米纖維三維支架的制備和其機械性能的提高，殼聚糖納米粒子對生物因子、基因的包載率、轉染率的提高，以及殼聚糖納米材料促進前成骨細胞或成骨細胞增殖及分化中的細胞信號轉導通路等。同時，制備殼聚糖納米材料支架也是未來研究方向之一，這種支架既具有高的機械性能，結構、形態(tài)類似天然骨細胞外基質(zhì)，又可作為生物活性因子和外源基因的緩釋載體。

另外，作為天然生物材料，殼聚糖主要從甲殼類動物蝦、蟹、昆蟲的外殼中通過堿處理或酶解脫乙?；茫涿撘阴６?30% ～95%)及分子量(30～1000 kDa)因原材料來源、制備方法及制備條件的不同而變化［2，5］。目前，研究對殼聚糖物理性能的要求僅限于殼聚糖的脫乙酰度及分子量，而對殼聚糖提取的純度、雜蛋白的種類和含量以及安全性標準的研究尚比較缺乏。而且，酸堿化學處理提取殼聚糖的方法對環(huán)境會造成一定的影響，其制取方法還需進一步改善。

總之，殼聚糖納米材料支架和作為緩釋載體的殼聚糖納米粒子在骨組織工程與再生醫(yī)學的研究中具有廣闊的空間，且有望在骨缺損修復再生中得以臨床應用。

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