王麗婷 周 鋼 樊瑜波*

1(北京航空航天大學(xué)生物與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，北京 100191)

2(國家康復(fù)輔具研究中心，北京 100176)

引言

隨著納米生物技術(shù)的飛速發(fā)展，納米生物材料對組織器官的負面作用逐漸成為人們關(guān)注的問題之一。納米羥基磷灰石復(fù)合材料因其良好的力學(xué)特性和骨誘導(dǎo)性［1］，成為納米骨組織工程支架的常用材料。但是復(fù)合材料進入體內(nèi)，隨著植入時間的延長，人體的頻繁活動所致的應(yīng)力環(huán)境以及生理環(huán)境的腐蝕、磨損，復(fù)合材料植入體表面會不斷降解，因而造成降解成分以及磨損粒子向周圍組織擴散，逐漸沉積到各個器官，經(jīng)過機體代謝排出體外。納米的尺度效應(yīng)是否帶來相應(yīng)的負面作用，還需要深入的研究證實。Scheel等觀察HA材料在鼠巨噬細胞中的生物相容性［2］，發(fā)現(xiàn)ROS形成增加明顯增強了細胞毒性，腫瘤壞死因子－a(TNF－alph)的釋放增加。Liao發(fā)現(xiàn)納米HA/膠原(nHAC)復(fù)合物使中性粒細胞釋放乳酸脫氫酶(LDH)和TNF－alpha顯著增加［3］。使用共沉淀和粒子瀝濾法制備多孔結(jié)構(gòu)的殼聚糖/HA納米復(fù)合材料［4］，植入SD大鼠背部皮下，3周后，發(fā)現(xiàn)有輕微炎癥，新生血管和巨細胞的出現(xiàn)。以上研究表明，納米HA復(fù)合材料通過誘導(dǎo)細胞炎癥，導(dǎo)致細胞壞死對機體產(chǎn)生了相應(yīng)的作用。

本研究使用共沉淀法制備了納米羥基磷灰石與殼聚糖 n－HA/CS(70:30)的復(fù)合材料［5］，并采用紅外光譜分析(IR)、X射線衍射(XRD)等手段表征該材料。通過體外細胞培養(yǎng)以及動物模型觀察該復(fù)合材料對細胞生長的作用以及在體內(nèi)代謝后的安全性，探索此類納米顆粒對組織器官的作用機理。

1 材料和方法

1.1 材料制備及表征

殼聚糖粉末購自濟南海得貝海洋生物工程有限公司，相對分子質(zhì)量約 45萬，N－脫乙酰度為95%。所用試劑均為分析純。通過以下步驟合成n－HA/chitosan復(fù)合材料。把殼聚糖溶解到2 wt%的乙酸中攪拌5 h，制備成濃度為3 wt%的脫乙酰殼聚糖溶液。然后，將10 wt%的H3PO4溶液與脫乙酰殼聚糖溶液混合。根據(jù) 70/30的 n－HA /chitosan重量比調(diào)整這些試劑。把chitosan/H3PO4溶液緩慢滴入到4%的乙醇溶液中，攪拌后用氫氧化鈣調(diào)節(jié)pH值至10，滴入速度大約為4 mL/min。繼續(xù)攪拌24 h，將得到的漿液老化24 h。最后過濾沉淀物，用去離子水洗滌，在80℃的真空烘箱中干燥。材料制備完成后，用XRD(XPert Pro MPDX射線衍射儀，荷蘭帕納科)和IR(Nicolet 170SX FT－IR光譜儀，美國)等方法進行表征。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和MTT比色

成骨細胞系(MC3T3－E1)細胞在37℃、5%CO2的條件下孵育，培養(yǎng)液用含10%胎牛血清(FCS)的培養(yǎng)基DMEM(Gibco)，加入1%青鏈霉素。含10%胎小牛血清的培養(yǎng)液配成單個細胞懸液，以1×104/mL的細胞濃度接種到96孔板，每孔體積200 μL，每孔接種的細胞數(shù)約為2×103。培養(yǎng)24 h后，加入不同濃度梯度的材料:10 μg/mL、100 μg/mL、1 mg/mL、10 mg/mL，并設(shè)立正常對照組。納米材料粉末紫外線照射12 h，用培養(yǎng)液稀釋。繼續(xù)在37℃，5%CO2條件下，培養(yǎng)細胞24 h。每孔加MTT 溶液20 μL(用 PBS 配制，pH=7.4)，繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加150 μL DMSO(Sigma，USA)，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。選擇490 nm波長，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀(Bio－Rad，USA)上測定各孔光吸收值。以時間為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制細胞的生長曲線。

1.2.2 動物試驗

選取成年SD大鼠，一次性給予大鼠腹腔注射納米羥基磷灰石/殼聚糖(n－HA/CS)復(fù)合材料，按照骨缺損材料400 mg/kg體重計算。根據(jù)不同的時間點分別設(shè)立對照組、1周組、2周組、4周組、8周組、每組8只。分別取血及肝臟、腎臟等組織。觀察復(fù)合材料的代謝產(chǎn)物隨血循環(huán)進入各重要組織的分布情況，以及其對機體肝、腎等主要器官的毒性作用。

1.2.3 血清生化檢查

大鼠各時間點心臟取血，4000 r/min離心10 min，取上清。日本東芝7170A型全自動生化分析儀進行血清生化指標檢測(北京友誼醫(yī)院)。具體指標包括乳酸脫氫酶(LDH)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶 (ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、總膽紅素(T－B)、間接膽紅素(IB)、血清尿素氮 (BUN)、肌酐 (CR)等。

1.2.4 病理切片

動物的肝臟、腎臟等組織被取出后，固定在10%福爾馬林溶液中。蠟塊包埋，切成5～6 μm薄片，用標準的組織切片技術(shù)處理，HE染色。光學(xué)顯微鏡觀察(U－III Multipoint Sensor System尼康，美國)。

1.2.5 統(tǒng)計分析

所有的數(shù)據(jù)用均數(shù) ±標準差(SD)表示。用SPSS 11.5版本進行方差分析(ANOVA)和L.S.D.測試來分析實驗組與對照組的差異性(P＜0.05)。

2 結(jié)果

2.1 材料的合成及形貌

圖1各子圖中曲線A～曲線C分別表示n－HA、CS 和 n－HA/CS 復(fù)合材料。圖 1(a)是 n－HA、CS 和n－HA/CS復(fù)合材料的紅外光譜(FT－IR)，曲線 A 除了特征PO43－、OH－、HO2的特征譜帶外，還觀察到了 874 cm－1和大約 1420 ～1480 cm－1處出現(xiàn)了CO32－譜帶，表明此為含碳酸羥基磷灰石。類似于天然骨磷灰石的組成。曲線B的光譜中顯示1655 cm－1處出現(xiàn)殼聚糖的酰胺Ⅰ特征譜帶，在1599 cm－1處的肩峰是由胺基的彎曲振動引起。而在HA/CS復(fù)合材料中(如曲線C所示)可以同時觀察到羥基磷灰石和殼聚糖的特征吸收峰，說明復(fù)合前后兩種單組分材料的化學(xué)組成未發(fā)生顯著變化。但殼聚糖的酰胺Ⅰ特征峰和HA的OH特征峰都向低波數(shù)方向發(fā)生了不同程度的位移。這說明CS的CO與HA中的—OH之間形成了氫鍵。

圖1(b)顯示了n－HA、CS和它們復(fù)合材料的X－射線衍射圖。曲線A中2θ=25.9°和30.8°兩處出現(xiàn)了羥基磷灰石晶面的特征衍射峰。曲線B中顯示了殼聚糖的兩個主要衍射峰。分別在2θ=10°和20°處?？梢悦黠@看出，以上兩種單組分的特征衍射峰都存在于兩元復(fù)合材料中。通過JADE 9軟件計算出，復(fù)合材料的晶體大小是31.44 nm。

2.2 不同材料對成骨細胞(MC3T3-E1)生長的影響

MTT試驗結(jié)果表明，不同濃度梯度(10 μg/mL、100 μg/mL、1 mg/mL、10 mg/mL)的 n－HA/CS 納米材料都抑制了MC3T3－E1細胞的生長，而且隨著納米材料濃度的升高，抑制作用更加明顯，呈現(xiàn)劑量依賴性，見圖2所示。

2.3 動物一般狀況

動物腹腔注射材料后，出現(xiàn)背毛松散，蜷縮成團，發(fā)抖，不食，嗜睡的狀況。1周處死的動物可見腹腔粘連嚴重，2周和4周處死的動物中，腹腔粘連逐漸減輕。但是到8周時，出現(xiàn)動物死亡的情況。大鼠脫毛現(xiàn)象嚴重，出現(xiàn)倦怠、厭食等現(xiàn)象。

2.4 血清生化

由于大鼠AST的正常范圍是96～200單位，AST數(shù)據(jù)變化始終在正常生理范圍，說明肝功能處于代償狀態(tài)(見表1)。反映膽管系統(tǒng)病變的T－B、IB早期稍有降低，但在8周時均出現(xiàn)明顯增高，具有顯著性差異。如圖3所示，X軸表示不同的降解時間，Y軸表示生化指標數(shù)值。

圖1 n-HA、CS和n-HA/CS復(fù)合材料表征。(a)紅外光譜(IR);(b)X-射線衍射圖(XRD)Fig.1 n-HA，CS and n-HA/CS composite material characterization.(a)Infrared Spectroscopy(IR);(b)X-ray diffraction(XRD)patterns

圖2 MC3T3-E1細胞在不同濃度的n-HA/CS復(fù)合材料作用下的生長曲線(＊＊:與對照組相比 P＜0.01)Fig 2 Different concentration of n-HA/CS composites on MC3T3 －E1 cells growth(＊＊:compared with the control，P ＜0.01)

腎臟相關(guān)指標的改變，CR在1～4周變化不明顯，但8周時，出現(xiàn)明顯升高。差異有顯著性 (P＜0.01)。而對于BUN，2周、4周時開始出現(xiàn)升高趨勢，并且相比于對照組，差異具有顯著性(P＜0.05)，到8周時，BUN升高明顯，相比于對照組，具有非常顯著的差異(P＜0.01)。

表1 n-HA/CS復(fù)合材料在大鼠體內(nèi)降解不同時間后生化指標的改變(n=8)Tab.1 Changes of serum biochemical indicators after n-HA/CS composites degradation for different times(n=8)

圖3 n-HA/CS復(fù)合材料對代謝器官的作用(各組分別與對照組相比，*:P＜0.05，＊＊:P ＜0.01)。(a)TB 和IB;(b)BUN和CRFig 3 Effects of n-HA/CS composites on metabolize organs(Compared with the control，*:P ＜0.05，＊＊:P＜0.01)(a)T-BI-B;(b)BUNCR

2.5 病理切片

n－HA/CS復(fù)合材料經(jīng)腹腔注射入大鼠體內(nèi)，通過血液循環(huán)將吸收入體內(nèi)的納米材料重新分布，材料在大鼠體內(nèi)分別代謝2、4、8周后，肝臟、腎臟的組織病理改變見圖4所示。n－HA/CS復(fù)合材料在體內(nèi)代謝2周開始，肝、腎組織中開始出現(xiàn)凋亡細胞，胞漿水分脫失，嗜酸性染色增強，細胞核固縮。而腎臟組織中，細胞凋亡現(xiàn)象更為明顯，凋亡細胞周圍未發(fā)現(xiàn)炎癥細胞浸潤。箭頭為組織中的凋亡細胞。

隨著作用時間的延長，肝、腎等代謝器官細胞凋亡程度逐漸增加。4周后，腎小管上皮凋亡細胞明顯增多，當(dāng)材料在體內(nèi)代謝至8周時，出現(xiàn)廣泛分布的凋亡細胞和大片嗜酸性染色區(qū)域，組織損傷嚴重，但凋亡細胞周圍仍無明顯炎癥細胞浸潤。

3 討論

納米生物材料對機體的負面影響可能涉及機體的很多系統(tǒng)，但其致病機理尚不明確。Watari F認為由于納米顆粒特異表面區(qū)域的尺寸效應(yīng)引起了化學(xué)反應(yīng)的增加，導(dǎo)致材料毒性［6］。Motskin認為，納米材料使細胞質(zhì)內(nèi)鈣離子的負荷增加，可能是導(dǎo)致細胞死亡的原因［7］。Lu研究證實，納米硅顆粒進入小鼠體內(nèi)誘發(fā)了炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)，最終導(dǎo)致了由中性粒細胞介導(dǎo)的肝細胞壞死［8］。氧化應(yīng)激反應(yīng)的增加可能是納米銅顆粒誘導(dǎo)腎足細胞凋亡的關(guān)鍵機制［9］。此外，納米材料對機體的其他作用機制還涉及蛋白質(zhì)變性退化，DNA損傷以及免疫反應(yīng)等。Yeo發(fā)現(xiàn)，納米銀離子導(dǎo)致與凋亡相關(guān)的P53基因途徑的表達發(fā)生改變，促進了凋亡的產(chǎn)生［10］。凋亡是由基因調(diào)控的細胞自主性、程序性死亡。作為細胞死亡的兩種不同方式，凋亡和壞死具有特征性的區(qū)別，具有其獨特的形態(tài)和生物化學(xué)特征。本研究通過血液生化指標的改變，以及病理切片組織的形態(tài)表現(xiàn)，從不同角度說明n－HA/CS復(fù)合材料在體內(nèi)分布后，導(dǎo)致肝臟和腎臟細胞出現(xiàn)了凋亡現(xiàn)象。

圖4 納米n-HA/CS復(fù)合材料對大鼠代謝器官的組織改變(100×，箭頭指凋亡細胞)。(a)正常肝組織;(b)正常腎組織;(c)2周后肝組織;(d)2周后腎組織;(e)4周后肝組織;(f)4周后肝組織;(g)8周后肝組織;(h)8周后腎組織Fig.4 Changes of n-HA/CS composites on tissue in metabolize organs(100 ×，Arrows indicate apoptotic cells).(a)Normal liver;(b)Normal renal;(c)Liver for 2 weeks;(d)Renal for 2 weeks;(e)Liver for 4 weeks;(f)Renal for 4 weeks;(g)Liver for 8 weeks;(h)Renal for 8 weeks

而對于納米顆粒造成細胞凋亡的研究目前多集中于抗癌藥物載體的研究，對于常用的生物醫(yī)學(xué)材料的凋亡研究還十分不足。本研究選取人工骨替代常用的復(fù)合材料，探索該材料在體內(nèi)代謝后對SD大鼠的主要代謝器官的影響。

本研究發(fā)現(xiàn)，n－HA/CS復(fù)合材料經(jīng)腹膜吸收入血，隨血循環(huán)重新分布，通過對肝臟、腎臟相關(guān)的生化指標檢測以及病理切片分析，觀察該納米材料進入大鼠體內(nèi)代謝不同時間后，對肝、腎等代謝器官功能的影響。結(jié)果顯示，含量為100 mg/kg的 n－HA/CS復(fù)合材料在體內(nèi)降解8周，AST與ALT始終在大鼠生理值范圍之內(nèi)，說明肝細胞沒有出現(xiàn)明顯的壞死和炎癥，未影響肝臟功能。但腎臟及膽管功能相關(guān)的指標卻出現(xiàn)明顯改變，2周時血尿素氮(BUN)水平開始增高，8周時 BUN、血肌酐(CR)及膽紅素水平明顯增高，說明此時腎臟及膽管功能已明顯受損。同時，組織病理切片的結(jié)果與生化指標的意義相一致，肝、腎組織中發(fā)現(xiàn)細胞凋亡，但無細胞壞死和炎癥細胞浸潤。腎臟組織中細胞凋亡的程度隨材料蓄積時間的延長而逐漸增加。雖然有研究發(fā)現(xiàn)，納米材料可導(dǎo)致肝細胞壞死［11］，這可能由于不同材料毒性作用機制不同而導(dǎo)致的。

如何理解細胞與納米生物材料相互作用的分子機制，使納米生物材料的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)與自然骨的力學(xué)特性相匹配;同時又能正確評估納米材料的生物安全性，以保障納米技術(shù)在納米醫(yī)學(xué)和納米生物學(xué)方面的更好應(yīng)用，這是納米生物材料工作者要面臨的重要挑戰(zhàn)。

4 結(jié)論

n－HA/CS復(fù)合材料能抑制MC3T3－E1成骨細胞的生長，在體內(nèi)經(jīng)過SD大鼠的肝臟、腎臟以及膽管等代謝器官時，可誘導(dǎo)組織細胞發(fā)生凋亡，當(dāng)?shù)蛲黾毎臄?shù)量超過一定限度，臟器功能出現(xiàn)失代償而引發(fā)一系列全身癥狀。但該材料誘導(dǎo)細胞凋亡的具體途徑還需進一步研究證實。

［1］Ou KL，Wu J，Lai WF，et al.Effects of the nanostructure and nanoporosity on bioactive nanohydroxyapatite /reconstituted collagen by electrodeposition ［J］.J Biomed Mater Res A，2010，92(3):906－912.

［2］Albrecht C，Scherbart AM，Berlo DV，et al.Evaluation ofcytotoxic effects and oxidative stress with hydroxyapatite dispersions of different physicochemical properties in rat NR8383 cells and primary macrophages［J］.Toxicol In Vitro，2009，23(3):520－530.

［3］Liao S，Tamura K，Zhu Y，et al.Human neutrophils reaction to the biodegraded nano－h(huán)ydroxyapatite/collagen and nanohydroxyapatite/collagen/poly(L－lactic acid)composites［J］.J Biomed Mater Res A，2006，76(4):820－825.

［4］Kashiwazaki H，Kishiya Y，Matsuda A，et al.Fabrication of porous chitosan/hydroxyapatite nanocomposites:Their mechanical and biological properties［J］.Biomed Mater Eng，2009，19(2):133－140.

［5］Zhou Gang，Li Yubao，Zhang Li et al.，Preparation and characterization ofnano－h(huán)ydroxyapatite/ chitosan / konjac glucomannan composite［J］.Journal of Biomedical Material Research Part A，2007，83A:931－939.

［6］Watari F，Abe S，Koyama C，et al.Behavior of in vitro，in vivo and internal motion of micro/nano particles of titanium，titanium oxides and others［J］.Journal of the Ceramic Society of Japan，2008，116(1349):1－5.

［7］Motskin M，Wright DM，Muller K，et al.Hydroxyapatite nano and microparticles:correlation ofparticle properties with cytotoxicity and biostability［J］.Biomaterials，2009，30(19):3307－3317.

［8］Lu Xiaoyan，Jin Tingting，Jin Yachao，et al.Toxicogenomic analysis of the particle dose－ and size－response relationship of silica particles－induced toxicity in mice ［J］.Nanotechnology，2013，24(1):015106.

［9］Xu Pengjuan，Xu Jing，Liu Shichang，et al.Nano copper induced apoptosis in podocytes via increasing oxidative stress［J］.J Hazard Mater，2012，241 －242:279 －286.

［10］Yeo MK，Pak SW.Exposing zebrafish to silver nanoparticles during caudal fin regeneration disrupts caudal fin growth and p53 signaling［J］.Molecular＆Cellular Toxicology，2008，4(4):311－317.

［11］Chen Jinyuan，Dong Xia，Zhao Jing，et al.In vivo acute toxicity of titanium dioxide nanoparticles to mice after intraperitioneal injection［J］.J Appl Toxicol，2009，29(4):330 －337.