盧婷，劉金福，劉偉，李有起

（1.鄭州大學(xué)生物工程系，河南鄭州450001；2.天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)系，天津300384；3.天津市食品研究所有限公司，天津301609）

超高壓技術(shù)（high pressure，HP）是一種主要的非熱加工技術(shù)。與傳統(tǒng)的熱加工相比，超高壓加工具有殺菌溫度低，能更好的保持食品固有的營(yíng)養(yǎng)成分、質(zhì)構(gòu)、色澤和新鮮度等特點(diǎn)?，F(xiàn)在國(guó)內(nèi)外對(duì)超高壓加工產(chǎn)品的研究重點(diǎn)已經(jīng)由抑菌、鈍酶的作用向引起產(chǎn)品的理化性質(zhì)變化的質(zhì)構(gòu)、化學(xué)、營(yíng)養(yǎng)學(xué)、生物學(xué)等更深入的方向進(jìn)行?？O蟶（Sinonovacula constricta lamarck），俗稱蟶子[1]，它主要分布于西太平洋沿海的中國(guó)、日本和朝鮮，被稱為四大養(yǎng)殖貝類之一[2]?？O蟶肉味鮮美，是高蛋白、低熱量、低脂肪的健康海洋食品之一。現(xiàn)在市場(chǎng)上出售的主要是生鮮縊蟶或加工的蟶干，但縊蟶容易腐敗，很難長(zhǎng)途運(yùn)輸，所以嚴(yán)重限制了市場(chǎng)范圍。通過(guò)比較熱加工、超高壓加工與未處理生鮮縊蟶的感官品質(zhì)、蛋白變性程度及酶解效果等，為縊蟶的深加工提供借鑒。

1 材料與儀器

1.1 材料

縊蟶：天津市紅旗農(nóng)貿(mào)批發(fā)市場(chǎng)；中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶：天津市諾奧生物技術(shù)有限公司，經(jīng)測(cè)酶活力分別為242 588、133 767、3 480 U/g；胃蛋白酶：四川省德陽(yáng)市生化制品有限公司經(jīng)測(cè)酶活力3 011 U/g。

1.2 設(shè)備

電熱恒溫水浴鍋：天津市華北實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；紫外分光光度計(jì)WFJ7200：尤尼柯（上海）儀器有限公司；電子天平JA 2003：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；酸度計(jì)：HANNA；凱氏定氮儀UDK 159 DKL：VELP SCIEWTIFICA；離心機(jī)Anke 7DL-5：上海安亭科學(xué)儀器廠；差示掃描量熱儀（DSC）200F3：德國(guó)耐馳熱分析儀器；核磁共振儀：上海紐邁電子科技有限公司；磁力攪拌器JB-3：上海雷磁新涇儀器有限公司；真空干燥箱DZF-6210：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；超高壓設(shè)備：天津光輝有限公司提供。

2 方法

2.1 縊蟶處理方法

熱加工：100 ℃下蒸煮5 min[3]。

超高壓加工：500 MPa，20 ℃下保壓15 min，在此反應(yīng)條件下，具有較好的殺菌效果。該產(chǎn)品在4 ℃條件下保鮮效果很好，貨架期為8 d～9 d[4]。

2.2 酶解工藝流程

2.3 測(cè)定方法

2.3.1 蛋白酶酶活力測(cè)定

SB/T 10317-1999《蛋白酶活力測(cè)定法》。

2.3.2 縊蟶水分的測(cè)定

GB/T 5009.3-2010《食品中水分的測(cè)定》。

2.3.3 縊蟶蛋白測(cè)定

微量凱氏定氮法[5]。

2.3.4 游離氨基態(tài)氮

甲醛滴定法[5-6]。

2.3.5 水解度的測(cè)定

水解度（DH）是衡量蛋白質(zhì)水解程度的重要指標(biāo)，指水解斷裂的肽鍵數(shù)目占總肽鍵數(shù)目的百分比。水解斷裂的肽鍵數(shù)可通過(guò)水解釋放出的氨基態(tài)氮數(shù)目來(lái)測(cè)定，按照下面公式計(jì)算[6-7]。

2.3.6 持水性的核磁共振測(cè)定法

核磁共振（Nuclear Magnetic Resonance，NMR）是指具有固定磁矩的原子核，在恒定磁場(chǎng)與交變磁場(chǎng)的作用下，以磁電波形式吸收或釋放能量，發(fā)生原子核的躍遷，同時(shí)產(chǎn)生核磁共振信號(hào)，即原子核與射頻區(qū)電磁波發(fā)生能量交換的現(xiàn)象。根據(jù)分辨率差異可分為高低分辨率兩種類型。低場(chǎng)核磁共振（Low field nuclear magnetic resonance，LF-NMR）指磁場(chǎng)強(qiáng)度在0.5 T以下的核磁共振，檢測(cè)樣品的物理性質(zhì)[8]。

2.3.7 蛋白質(zhì)變性程度的DSC 測(cè)定

差示掃描量熱法 （Differential Scanning Calorimetry，DSC）是在程序控制溫度下，測(cè)量輸給物質(zhì)和參比物功率差與溫度關(guān)系的一種技術(shù)。稱取15 mg～30 mg 的經(jīng)處理后的縊蟶勻漿放入樣品池，密封后放入儀器中，以空氣作為參比物，保護(hù)氣為氮?dú)猓锼俾?0 ℃/min，從30 ℃升溫至90 ℃[9]。

3 結(jié)果與討論

3.1 不同處理的縊蟶肉質(zhì)持水性分析

采用核磁共振方法，實(shí)驗(yàn)參數(shù)如下：PulSeqType=2；SF1（MHz）=22；O1（kHz）=963.296 7；P90（us）=13.5；P180（us）=27.0；TD=160 040；SW（kHz）=200；D3（us）=75；TR（ms）=2 500；RG1=20；RG2=3；NS=4；EchoTime（us）=200.00；EchoCount=2 000；GA1（%）=0，對(duì)生鮮、加熱、超高壓蟶子進(jìn)行核磁共振檢測(cè)，圖譜如圖1 所示。

圖1 不同處理方法縊蟶核磁共振弛豫時(shí)間分布Fig.1 NMR relaxation time distribution of Sinonovacula constricta lamarck by different treatment methods

肉制品水分的橫向弛豫時(shí)間（T2）呈多指數(shù)衰減，一般T2可以分為T21（0 ms～10 ms）、T22（10 ms～100 ms）、T23（100 ms 以上），分別對(duì)應(yīng)結(jié)合水、不易流動(dòng)水、自由水[10]。肌原纖維蛋白質(zhì)變性對(duì)肉制品具有重要的影響，利用低場(chǎng)核磁共振（Low field nuclear magnetic resonance，LF-NMR）質(zhì)子弛豫行為測(cè)定水分分布，可以判斷蛋白質(zhì)變性情況[11]。Bertram 研究發(fā)現(xiàn)，T21主要與存在機(jī)體中的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)有關(guān)，T22與肌原纖維之間的空間水分有關(guān)[12]。蛋白質(zhì)變性主要是導(dǎo)致聚集的β-折疊構(gòu)象增加，天然的β-折疊和α-螺旋結(jié)構(gòu)降低，從而導(dǎo)致T21分布變寬，對(duì)應(yīng)面積增大。同時(shí)，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致結(jié)合于蛋白質(zhì)上的結(jié)合水結(jié)合的松弛，當(dāng)水分結(jié)合的越緊密松弛時(shí)間越短，故而隨著蛋白質(zhì)變性程度的加深，T2出峰的時(shí)間越來(lái)越靠后。

由圖1 可以看出，生鮮縊蟶T21首峰峰起時(shí)間為0.657 933 ms，面積約為16.57；加熱5 min 后縊蟶T21首峰峰起時(shí)間為1.149 76 ms，面積約為21.23；超高壓后縊蟶T21首峰峰起時(shí)間為0.869 749 ms，面積約為17.26。加熱縊蟶的峰面積＞超高壓縊蟶的峰面積＞生鮮縊蟶的峰面積，且T2的出峰時(shí)間的先后順序依次為：生鮮縊蟶、超高壓縊蟶、加熱縊蟶。無(wú)論是從T2的出峰時(shí)間還是T21的峰面積大小均可看出：加熱處理使得縊蟶蛋白質(zhì)變性程度大，對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)影響更大。

3.2 不同處理的縊蟶蛋白質(zhì)變性分析

差示掃描量熱法（DSC）對(duì)研究天然聚合物的結(jié)構(gòu)和熱力學(xué)特征是一種非常有效的工具，近年來(lái)逐漸被食品界用來(lái)進(jìn)行蛋白質(zhì)變性和組織結(jié)構(gòu)變化的研究[9]。不同處理得到的縊蟶勻漿DSC 掃描圖譜如圖2。

圖2 不同處理方法的縊蟶DSC-溫度曲線Fig.2 DSC-temperature curve of Sinonovacula constricta lamarck by different treatment methods

生鮮縊蟶DSC 圖譜在35 ℃附近出現(xiàn)的為肌球蛋白峰，在70 ℃附近出現(xiàn)的為肌動(dòng)蛋白峰。經(jīng)過(guò)超高壓處理縊蟶的兩個(gè)峰趨于平緩，加熱處理后的峰更加平緩。表明超高壓和加熱處理使維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的氫鍵斷裂，從而引起肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白發(fā)生不可逆的變性，加熱處理變性更為明顯。

3.3 產(chǎn)品成分及感官評(píng)價(jià)

加熱、超高壓處理后縊蟶的水分及蛋白含量與未處理生鮮縊蟶水分蛋白含量比較如表1 所示，在色澤、形態(tài)、風(fēng)味及質(zhì)地[13]四個(gè)方面進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，如表2 所示。

通過(guò)表1 可以看出超高壓處理后縊蟶含水量高，加熱處理使得縊蟶嚴(yán)重脫水。上述核磁共振分析的結(jié)果在感官評(píng)價(jià)中得到了同樣的反映。對(duì)兩種縊蟶成品進(jìn)行感觀評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn)，超高壓處理的縊蟶肉質(zhì)白色，蛋白質(zhì)發(fā)生了一定的變性，但其形態(tài)變化不大，口感滑嫩；加熱處理的縊蟶肉質(zhì)較老韌?？梢?，對(duì)縊蟶進(jìn)行超高壓加工可以開發(fā)出口感獨(dú)特的產(chǎn)品。

表1 縊蟶水分及蛋白含量Table1 WaterandproteincontentofSinonovaculaconstrictalamarck

表2 加熱和超高壓縊蟶的感官評(píng)價(jià)Table 2 Sensory evaluation of Heating and high pressure Sinonovacula constricta lamarck

3.4 不同處理的縊蟶蛋白質(zhì)的酶水解及效果

利用正交實(shí)驗(yàn)，測(cè)定中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶分別酶解三種不同處理的縊蟶勻漿，測(cè)定酶解后的水解度，結(jié)果見表3、表4、表5和表6。

使用四種已知酶活力的不同蛋白酶對(duì)縊蟶進(jìn)行酶解，均表現(xiàn)出生鮮縊蟶的水解度最大，500 MPa，15 min 超高壓處理縊蟶蛋白的水解度高于100 ℃加熱5 min 縊蟶的水解度的現(xiàn)象。查看資料發(fā)現(xiàn)，不同來(lái)源的動(dòng)物蛋白變性后酶解效果不同，雞肉和蛋類蛋白質(zhì)經(jīng)加熱變性后，更容易酶解[14-15]，而對(duì)于魚、貝等水產(chǎn)品情況恰好相反，加熱蛋白質(zhì)變性后，更不容易酶解[3]。本實(shí)驗(yàn)也得到類似結(jié)果：加熱容易導(dǎo)致縊蟶蛋白質(zhì)脫水和變性，對(duì)蛋白酶的酶解作用影響更大，比生鮮縊蟶蛋白的水解度明顯降低。超高壓處理也會(huì)引起縊蟶蛋白變性，但持水性較高，形態(tài)變化不大，與未處理的生鮮縊蟶接近，酶解相對(duì)容易些 由此可知，對(duì)縊蟶進(jìn)行酶解加工生產(chǎn)蛋白肽等產(chǎn)品時(shí)，使用生鮮縊蟶為原料更容易獲得水解液；生鮮縊蟶、超高壓加工的縊蟶可能比熱加工的產(chǎn)品更易于被人體消化吸收，有待于進(jìn)一步深入研究。

表3 中性蛋白酶酶解水解度Table 3 Hydrolysis degree of bacillus protease

表4 木瓜蛋白酶酶解水解度Table 4 Hydrolysis degree of papain

表5 胰蛋白酶酶解水解度Table 5 Hydrolysis degree of trypsin

表6 胃蛋白酶酶酶解水解度Table 6 Hydrolysis degree of pepsin

4 結(jié)論

通過(guò)差示掃描量熱儀（DSC）和核磁共振（NMR）的檢測(cè)分析方法，對(duì)加熱、超高壓處理的縊蟶蛋白質(zhì)變性程度進(jìn)行分析，100 ℃加熱處理5 min，縊蟶蛋白質(zhì)變性程度要遠(yuǎn)高于超高壓500 MPa，20 ℃，15 min 處理的產(chǎn)品。經(jīng)感官評(píng)價(jià)，通過(guò)超高壓法制得的縊蟶產(chǎn)品，色澤、形態(tài)完好，口感滑嫩獨(dú)特，且可以殺菌、鈍酶，延長(zhǎng)產(chǎn)品的貨架期[4]。超高壓技術(shù)是對(duì)縊蟶進(jìn)行深加工，開發(fā)新產(chǎn)品的重要途徑。

不同蛋白酶的酶切位點(diǎn)不同，會(huì)導(dǎo)致水解度不同，同時(shí)蛋白質(zhì)的變性程度和方式也會(huì)影響酶解效果。胰蛋白酶對(duì)縊蟶蛋白的水解效果最佳，而后依次為胃蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶。采用500 MPa，20 ℃，15 min 超高壓處理、100 ℃加熱處理5 min 和生鮮縊蟶原料比較，四種蛋白酶均對(duì)生鮮縊蟶蛋白質(zhì)的水解度最高。

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